抗草甘膦轉基因豆粕對肉仔雞腸黏膜免疫的影響

譚建莊 劉莎莎,2 孫 哲 張宏福＊ 盧慶萍 薩仁娜 趙 峰 楊曉光

草甘膦是一種高效低毒的除草劑,主要通過抑制植物體內芳香族氨基酸合成的關鍵酶——5-烯醇丙酮酸莽草酸 -3-磷酸合成酶(EPSPS)的合成來發揮作用。孟山都公司通過基因工程手段向常規大豆中轉入 CP4-EPSPS基因,使大豆能高效表達出 EPSPS,從而使大豆具備了對草甘膦的耐受性,即抗草甘膦轉基因大豆(glyphosate-tolerant soybean)。豆粕是我國畜牧養殖業最重要的蛋白質飼料原料之一,目前我國市場上有 70%以上的豆粕是抗草甘膦轉基因豆粕(glyphosate-tolerant soybean meal),其潛在的生物安全性問題備受關注。前人對抗草甘膦轉基因豆粕的飼用安全性的研究主要集中在對抗草甘膦轉基因豆粕的化學成分的比較分析[1-2],飼喂含抗草甘膦轉基因豆粕的飼糧對動物生長性能、屠宰性能[3-5]和繁殖性能[6]的影響,以及外源 DNA和蛋白質在動物體內的殘留檢測[7-8]等方面,而對動物免疫功能影響的研究報道較少。小腸是肉雞的主要消化器官,也是機體抵御飼料中有害抗原入侵的第一道免疫屏障[9],腸黏膜免疫是機體免疫的重要組成部分。腸黏膜免疫屏障主要由免疫細胞、免疫球蛋白和細胞因子等組成[10]。本試驗旨在通過研究飼喂含抗草甘膦轉基因豆粕的飼糧對肉仔雞腸黏膜免疫屏障的影響,從黏膜免疫方面評價抗草甘膦轉基因豆粕的飼用安全性,為轉基因飼料的安全性評價提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與動物分組

試驗選用 1日齡愛拔益加(AA)肉仔雞 360只,公母混養,隨機分為 2組,每組 5個重復,每個重復 36只雞。每籠為 1個重復,各重復隨機排布于雞舍的不同位置,分別飼喂含抗草甘膦轉基因豆粕和常規非轉基因豆粕的飼糧。采用 3層立體籠養,常規免疫程序進行免疫,自由采食飲水,試驗期 21 d。

1.2 豆粕與試驗飼糧

試驗用轉基因豆粕品種為孟山都 RR抗草甘膦轉基因大豆(40-3-2),由秦皇島金海糧油工業有限公司提供;常規非轉基因豆粕品種為國產大豆,由黑龍江慶豐集團克山昆豐油脂有限公司提供。

試驗飼糧采用玉米 -豆粕型飼糧,參照 NY/T 33—2004 0～3周齡肉雞營養需要推薦量配制,其組成及營養水平見表 1。

表1 飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the diets(air-dry basis) %

1.3 樣品采集和處理

于試驗第 21天從每個重復隨機選取 3只雞屠宰,快速取十二指腸(派依爾節處)、空腸(卵黃蒂前 1 cm處)和回腸(回盲口前 5 cm處)各 1 cm,立即置于 4%的甲醛溶液中固定,常規石蠟包埋、連續切片,切片厚 5μm。

取空腸組織 2 g、空腸食糜(卵黃蒂前 5 cm處)2 g于 Axgen離心管中,液氮速凍,-80℃保存。稱取空腸組織 100 mg于 1 mL細胞裂解液(北京賽馳生物科技有限公司)中,在玻璃勻漿器冰浴勻漿,4℃ 10 000 r/min離心 5 min,取上清液;稱取 500 mg空腸食糜于 1.5 mL 0.01 mol/L的 PBS(pH=7.2)中,渦旋混勻,10 000 r/min離心 5 min,取上清液。取空腸組織勻漿和食糜上清液,采用碧云天 BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量后,-20℃保存備測其他指標。

1.4 指標測定方法

蘇木素 -伊紅(HE)染色,400倍光學顯微鏡下觀察,每張切片選取 5根走向平直、完整的小腸絨毛,統計 100個小腸上皮內淋巴細胞(intestinal intraepithelial lymphocytes,iIEL)的數量。

空腸食糜上清液中分泌型免疫球蛋白 A(sIgA)含量的測定,采用美國 Bethy公司 IgA酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)試劑盒(貨號為:E30-103);組織勻漿上清液中輔助性 T細胞(T helper cells,Th1、Th2)細胞因子白細胞介素 -2(IL-2)和白細胞介素 -6(IL-6)含量的測定采用美國 Rapidbio公司的 ELISA試劑盒(貨號分別為:11R020和11R040)。sIgA含量以 sIgA測定值與食糜上清液中總蛋白含量的比值(μg/mg)表示;IL-2和 IL-6含量以測定值與組織勻漿上清液中總蛋白含量的比值(pg/mg)表示。

1.5 數據分析

采用 SAS 8.0中 2樣品平均值的 T檢驗程序進行顯著性分析,數據以“平均值 ±標準誤”表示,P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 抗草甘膦轉基因豆粕對肉仔雞 iIEL數量的影響

由圖 1可以看出,轉基因豆粕組肉仔雞小腸絨毛結構正常,iIEL散布于小腸絨毛上皮柱狀細胞之間,胞漿極少,細胞核大而圓,染色較深,同常規豆粕組肉仔雞相比,未見明顯變化。從表 2的數據可以看出,轉基因豆粕組與常規豆粕組肉仔雞小腸(十二指腸、空腸和回腸)iIEL數量均無顯著差異(P＞0.05)。同時可以看出各處理肉仔雞iIEL數量從十二指腸、空腸到回腸依次遞減。

表2 小腸上皮內淋巴細胞數量Table 2 Number of intraepithelial lymphocytes in small intestine cell/100 absorb cells

2.2 抗草甘膦轉基因豆粕對肉仔雞空腸食糜中sIgA含量及組織中 Th1/Th2細胞因子水平的影響

由表 3、表 4可以看出,在試驗第 21天,轉基因豆粕組與常規豆粕組肉仔雞空腸食糜中 sIgA含量無顯著差異(P＞0.05);2組肉仔雞空腸組織中Th1細胞因子 IL-2和 Th2細胞因子 IL-6的含量及IL-2/IL-6均差異不顯著(P＞0.05)。

表3 抗草甘膦轉基因豆粕對肉仔雞空腸食糜中 sIgA含量的影響Table 3 Effects of glyphosate-tolerant soybean meal on the sIgA content in jejunum chyme of broilersμg/mg

表4 抗草甘膦轉基因豆粕對肉仔雞空腸組織中細胞因子含量的影響Table 4 Effects of glyphosate-tolerant soybean meal on the contents of cytokines in jejunum tissue of broilers pg/mg

3 討 論

3.1 抗草甘膦轉基因豆粕對肉仔雞 iILE數量的影響

小腸黏膜內淋巴細胞群是腸黏膜免疫的主要效應器官,它主要存在于小腸絨毛上皮和固有層內。iIEL以 T淋巴細胞為主(約占 80%),但也有少量的 K(kill)細胞和 NK(natural kill)細胞。它的功能主要是保護機體免受腸腔病原體和毒素的侵害及分泌細胞因子[11-12]。本研究結果顯示,飼喂含抗草甘膦轉基因豆粕的飼糧沒有引起肉仔雞 iIEL數量的變化,沒有引起肉仔雞 iIEL的異常免疫反應,未對肉仔雞 iIEL的免疫功能產生不良影響。且 iIEL數量呈現出從十二指腸到回腸逐漸降低的趨勢,這與楊倩等[13]、楊玉榮等[14]報道的正常 iIEL變化結果一致。

3.2 抗草甘膦轉基因豆粕對肉仔雞空腸食糜中sIgA含量的影響

sIgA是腸黏膜免疫中的主要效應因子,它具有阻斷腸道病原微生物和抗原物質對腸黏膜的黏附、中和病毒和毒素、激活補體等作用[15]。當腸腔中sIgA分泌不足時,腸黏膜會因為食物中的病原體或其他大分子抗原的侵害,產生免疫炎癥。腸腔 sIgA分泌量的改變是評價腸黏膜免疫功能的一項重要指標[16]。本試驗研究顯示,轉基因豆粕組與常規豆粕組空腸食糜中 sIgA含量無顯著差異,表明飼喂含抗草甘膦轉基因豆粕的飼糧沒有對 sIgA的分泌造成不良影響。

3.3 抗草甘膦轉基因豆粕對肉仔雞空腸組織中Th1/Th2細胞因子分泌的影響

輔助性 T細胞是機體重要的免疫調節細胞,根據其產生細胞因子的不同可以分為 Th1和 Th2亞群。Th1亞群主要分泌 IL-2、干擾素 -γ(IFN-γ)、干擾素 -α(IFN-α)和腫瘤壞死因子 -β(TNF-β)等,主要參與細胞免疫;Th2亞群主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和 IL-13等,主要參與體液免疫。在正常生理狀態下,Th1/Th2處于一個動態平衡狀態,Th1/Th2的不平衡可造成疾病的不同病理狀態。本試驗研究結果顯示,在試驗第 21天,常規豆粕組與轉基因豆粕組肉仔雞 IL-2和 IL-6的分泌量差異不顯著,IL-2/IL-6差異不顯著,表明飼喂含抗草甘膦轉基因豆粕的飼糧未對肉仔雞空腸組織中Th1/Th2細胞因子的分泌及其免疫平衡產生不良影響,同時也說明飼喂抗草甘膦轉基因豆粕沒有引起肉仔雞腸黏膜產生病理性變化。

Finamore等[17]研究顯示斷奶小鼠在連續飼喂轉基因 Bt蛋白玉米(Mon810)30 d后,血清中 Th1細胞因子 IFN-γ含量雖未出現顯著變化,但是血清中 Th2細胞因子IL-6和IL-13的含量顯著增加。這表明飼喂轉基因玉米引起了斷奶小鼠 Th1/Th2免疫平衡向 Th2方向偏移,與本試驗結果不同,具體是由于試驗動物的不同、還是由于試驗材料的不同而導致還有待進一步研究驗證。

4 結 論

飼喂含抗草甘膦轉基因豆粕的飼糧在試驗期間未引起肉仔雞 iIEL數量、空腸食糜中 sIgA含量和空腸組織中 Th1/Th2細胞因子的含量發生顯著性變化,未對所檢測的各項腸黏膜免疫指標產生不良影響。

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