基于 T型套管瘺術的雞小腸食糜流量變異規律的研究

張建智 趙 峰 張宏福 王洪榮

在家禽體外模擬消化技術的研究中,首先需要闡明腸道的代謝規律。然而家禽的腸道較細,腹腔狹小,文獻報道的家禽腸道消化液組成參數多通過屠宰取食糜的方法從死禽體內獲得,所得信息的可靠性差。因此,如何解決在可大量獲取有代表性腸道食糜后研究小腸各段食糜的特性,對體外模擬消化過程的建立非常重要。自 20世紀 50年代以來,人們在禽用腸道套管的研制上進行了許多嘗試,Dixon等[1]利用結腸造口術測定了雞飼料消化能,Johns等[2]利用回腸套管測定了雞回腸氨基酸消化率。然而,這些研究多是采用玻璃管或 1 mL硬質塑料注射器作為套管,經常出現套管脫落或滑入腹腔,食糜在套管管型部干涸、堵塞及自泌樣品無法低溫保鮮等一系列問題。近年來,本研究組所在的動物營養學國家重點實驗室分別從禽用套管、套管塞、采樣瓶、荷術外科手術等幾個方面進行了系統研究[3],并申報了禽用腸道套管的國家專利(專利申請號:zl201020257424.3;zl201030236703.7)。這為大量獲取家禽腸道消化生理信息的基礎參數提供了創新手段。通過該套管技術,本實驗室曾以北京鴨為試驗動物,系統研究了鴨腸液中主要消化酶活性的晝夜變異規律及飼糧營養水平對腸液組成的影響[4-5]。然而,在小腸消化特性的研究上,雞和鴨在體重、腸道尺寸上存在著較大的差異,且不同腸段食糜的流量也有各自的特性,該套管技術是否適合于雞小腸消化生理的研究,通過腸道套管所獲得的十二指腸、空腸、回腸食糜有哪些特性等問題仍有待深入研究。為此,本試驗選用在代謝能測定中常用的成年蛋公雞為試驗動物,分別在十二指腸、空腸、回腸安裝 T型套管,通過觀察試驗雞術后的健康狀況及各腸段食糜、食糜干物質、腸液、腸液總蛋白流量的日內變異和日間變異,探討基于 T型套管瘺術的雞腸道各段食糜的基本生物學特性,從而為雞體外模擬消化方法的研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及套管安裝

選擇 18周齡健康、體重基本一致[平均體重為(2.30±0.19)kg]的成年海蘭褐佳蛋公雞114只,隨機分為 3組,每組 38只。根據本實驗室禽用 T型套管安裝方法[3],分別在試驗雞十二指腸、空腸、回腸安裝套管。其中十二指腸套管安裝在 U形彎曲段的大彎處,空腸套管安裝在卵黃囊憩室附近 2 cm范圍內,回腸套管安裝在距回盲結合部約 10 cm處。最終安裝 T型套管荷術雞 110只,其中十二指腸、空腸、回腸荷術雞分別為 35、38和 37只。

術前絕食 24 h,術后試驗雞放于代謝籠單籠飼養,禁飼 3 d,自由飲水。每只雞每日護理 3次:口服青霉素 20萬單位、鏈霉素 5萬單位,灌服補液(0.9%NaCl、10%葡萄糖各 30 mL),并用碘酊、酒精棉擦拭術部。集中護理 3 d,第 4天、第 5天開始限飼(15 g/只),以后每日的限飼量在前 1天基礎上增加 15 g,直至術后 10 d左右恢復自由采食(110 g/只)。第 10天開始拆線并去掉套管墊圈。術后 15 d荷術雞自由采食玉米 -豆粕型飼糧(表 1),飼養管理按照動物營養學國家重點實驗室的常規程序進行。

1.2 試驗設計

采用 3×6完全隨機設計,其中采樣日期設 3個處理,即術后第 31天、第 34天、第 37天采樣。日內采樣時間設 6個處理,即采樣日內的 09:30—10:30、13:30—14:30、 17:30— 18:30、 21:30—22:30、01:30— 02:30、05:30— 06:30,通過套管收集 1 h腸道食糜樣品。待荷術雞經過 20 d的恢復期后,分別從 3組健康荷術雞(十二指腸荷術雞 35只,空腸荷術雞 32只,回腸荷術雞 33只)中各隨機選擇 15只,分為 5個重復,每個重復 3只雞。根據兩因素完全隨機設計方案分配到每個處理中。

表1 飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the diet(air-dry basis) %

1.3 樣品制備及測定指標

每次準確收集 1 h食糜樣品后,測定食糜的體積并稱重。同時,取上清液 6～12 mL,分裝于1.5 mL離心管中,于 -20℃保存。剩余食糜轉入培養皿,放入烘箱,先 65℃烘 12 h,然后 105℃烘4 h,測食糜絕干重。

將保存的食糜上清液在 4℃﹑ 1 250×g條件下離心 10 min,離心結束后于 40℃水浴鍋恒溫加熱 3 min,并吸取 1 mL測定腸液比重,同時根據腸液比重計算腸液的體積。計算公式如下:

腸液總重(g/h)=食糜總重(g/h)-食糜干物質總重(g/h);

腸液流量(mL/h)=腸液總重(g/h)/腸液比重(g/mL);

腸液總蛋白流量(mg/h)=腸液總蛋白含量(mg/mL)×腸液流量(mL/h);

食糜干物質含量(g/mL)=食糜干物質流量(g/h)/食糜流量 (mL/h)。

腸液總蛋白含量采用南京建成生物工程研究所提供的考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(人份:100T;批號:20101015)測定。

1.4 統計分析

統計學檢驗利用 SAS 9.1[6]軟件 ANOVA模塊對術后體重進行方差分析。

統計模型為:Yij=μ+Wi+ξij。

式中,μ為總體平均值,W為體重,ξij為隨機誤差項。

利用 SAS 9.1[6]軟件的 UNIVARIATE、ANOVA程序分別對各處理間的數據進行正態性與方差齊次性檢驗。

采用 3×6完全隨機模型進行統計分析,模型為:

式中,μ為總體平均值,D為日期,T為時間效應,ξijk為隨機誤差項。

試驗數據以平均值 ±標準誤表示,均值多重比較采用 Duncan氏法進行,顯著水平為 P＜0.05。

2 結 果

2.1 T型腸道套管荷術雞的健康狀況及術后體重的恢復

荷術雞在 1周內恢復采食,術部完全愈合。術后 1周內荷術雞主要表現為體重下降、雞冠暗紅、糞便稀少。而在隨后 1周內荷術雞雞冠鮮紅、羽毛整齊清潔、糞便呈現灰色或灰褐色。恢復期內有少數試驗雞喜好啄食術部及套管,傷口經多次清洗、消毒護理后 15 d內都能恢復到良好的狀態(表 2)。除個別荷術雞出現套管脫落、眼疾、抓雞應激等情況死亡外,其余荷術雞在術后 4個月內都健康、正常。術后 120 d時,十二指腸、空腸、回腸荷術雞健康的比例分別達到 80%、76%、81%。卡方檢驗表明,腸段不同部位安裝 T型套管,3組荷術雞間的手術成功率無顯著性差異(Х2=0.87,P＞0.05)。從試驗雞術后體重的恢復情況看,術后 20 d內 3組荷術雞的體重均呈現先下降然后逐漸恢復的變化。其中,十二指腸與回腸荷術雞在術后 20 d可恢復到術前體重,空腸荷術雞在術后 25 d也可恢復到術前體重。術后120 d,荷術雞的體重在術前體重的基礎上有顯著增加(P＜0.05)。此外,經統計分析,3組不同部位安裝套管的荷術雞在術后 10、20、25、120 d的體重上無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 雞腸道不同位點套管內自泌食糜及食糜干物質流量的日內及日間變異

從雞小腸不同位點(十二指腸、空腸、回腸)套管內食糜及食糜干物質流量(3 d流量的平均值)的差異看(表 3),十二指腸食糜的流量最大,約為空腸食糜流量的 3.3倍,回腸食糜流量的 4.3倍。十二指腸食糜的干物質含量與干物質流量也最高,其中干物質含量約為空腸食糜的 1.4倍,回腸食糜的 1.6倍;干物質流量約為空腸食糜的 5.0倍,回腸食糜的 7.6倍。在不同腸段食糜及干物質流量變異幅度的差異上,十二指腸中食糜流量的日內和日間變異系數約為空腸食糜流量相應變異系數的 2.3倍,回腸食糜流量的 1.6～3.3倍。十二指腸食糜干物質流量的日內和日間變異系數約為空腸食糜干物質流量相應變異系數的 1.9倍,回腸食糜干物質流量相應變異系數的 2.4～4.3倍。

從腸道食糜及干物質流量的日內變異看,十二指腸食糜及干物質流量在 3 d的采樣期內均呈現隨晝夜交替而逐步下降的變異規律,09:30—10:30的食糜流量顯著高于其他時間段食糜流量(P＜0.05),13:30—22:30食糜流量相對穩定,各時間段之間差異不顯著(P＞0.05),隨后呈現出下降規律,在 05:30—06:30達到最低值,顯著低于其他時間段(P＜0.05);而食糜干物質的流量在09:30— 10:30最高 (P＜0.05),在 13:30— 18:30干物質流量顯著地降低到一個較低的平臺期(P＜0.05),然后在 21:30—次日 06:30再次顯著地降低到一個更低的平臺期(P＜0.05)。在空腸食糜及干物質流量的日內變異上,09:30—14:30食糜流量呈現一個較高流量的平臺期,然后逐漸下降并在 21:30—次日 06:30達到一個新的較低流量的平臺期;而食糜干物質的流量在01:30—02:30達到最低值,顯著低于 09:30—14:30食糜干物質流量(P＜0.05),而 21:30—次日 06:30食糜干物質流量無顯著性變化(P＞0.05)。在回腸食糜及干物質流量的日內變異上,09:30—10:30的食糜流量與 01:30—06:30的食糜流量無顯著差異(P＞0.05),但顯著地低于13:30—18:30的食糜流量(P＜0.05),而 21:30—22:30的流量最低,顯著地低于其他時間段的食糜流量(P＜0.05);食糜干物質流量在 13:30—18:30最高,21:30—次日10:30食糜干物質流量無顯著性變化(P＞0.05)。

表2 術后荷術雞的健康狀況Table 2 Health status of cockerels after operation

在腸道食糜及干物質流量的日間變異上,十二指腸食糜在 3 d采樣期內平均每小時的流量隨采樣日期延后依次顯著降低(P＜0.05),其食糜干物質在第 3天采樣期內的平均流量顯著低于前 2天采樣期內的平均流量(P＜0.05)。而空腸食糜在第 1天采樣期內的平均流量顯著地高于其他 2 d的平均流量(P＜0.05),而后 2天的平均流量無顯著性差異(P＞0.05),其食糜干物質在第 3天和第 1天采樣期內的平均流量差異顯著(P＜0.05)。回腸食糜流量及食糜干物質流量 1 d內每小時的平均流量在3 d采樣日期內均無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 雞腸道不同位點套管內自泌腸液及腸液總蛋白流量的日內及日間變異

從雞小腸不同位點套管內腸液及腸液總蛋白流量(3 d流量的平均值)的差異看(表4),十二指腸腸液的流量最大,約為空腸腸液流量的 3.3倍,回腸腸液流量的 4.3倍。而空腸腸液總蛋白含量及流量最高,其中,腸液總蛋白含量約為十二指腸腸液總蛋白含量的 3.9倍,回腸腸液總蛋白含量的 1.6倍,流量約為十二指腸腸液總蛋白流量的 1.3倍,回腸腸液總蛋白流量的 2.1倍。在不同腸段小腸腸液及腸液蛋白流量變異幅度的差異上,十二指腸腸液流量的日內及日間變異最大,兩者均約為空腸腸液流量的 2.2倍,而日內變異約為回腸腸液流量的 1.6倍,日間變異為回腸腸液流量的 2.9倍。從腸液總蛋白流量看,十二指腸和空腸腸液總蛋白流量的日內變異相差不大,且都比回腸腸液總蛋白流量的日內變異大。空腸腸液總蛋白流量的日間變異最大,約為十二指腸腸液總蛋白流量的 5.1倍,回腸腸液總蛋白流量的 1.6倍。

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從小腸腸液及腸液蛋白流量的日內變異看,十二指腸腸液流量在測定平均值上隨晝夜變化呈現先降后升再降的變異規律,且 3 d采樣期內這種規律保持一致。但通過對 3 d測值的統計分析表明,09:30—次日 6:30,十二指腸腸液流量在 09:30—10:30的流量最大,顯著地高于其他時間的流量(P＜0.05);同時,01:30—02:30十二指腸腸液的流量顯著地高于 05:30—06:30流量的相應值(P＜0.05)。十二指腸腸液總蛋白的流量在 09:30—18:30處于較高的平臺期,在 21:30—次日 06:30處于一個相對較低的平臺期。空腸腸液流量在09:30—14:30呈現一個較高的平臺期,然后逐漸下降,并在 21:30—次日 06:30達到一個新的較低的平臺期;而空腸腸液總蛋白流量在09:30—14:30最高(P＜0.05),然后在 17:30—次日 06:30下降到一個相對穩定的水平。回腸腸液在 09:30—10:30的流量與 01:30—06:30的流量無顯著差異 (P＞0.05),顯著地高于 21:30—22:30的流量(P＜0.05),但顯著地低于 13:30—18:30的流量(P＜0.05);而回腸腸液總蛋白的流量卻呈現先下降后回升的變化規律。

從小腸腸液及腸液蛋白流量的日間變異看,十二指腸腸液在 3 d采樣期內平均每小時的流量隨采樣日期延后依次顯著降低(P＜0.05),而腸液總蛋白的流量在 3 d采樣期間無顯著差異(P＞0.05)。空腸腸液在第 1天采樣期內的平均流量顯著地高于其他 2 d的平均流量(P＜0.05),后2天的平均流量無顯著性差異(P＞0.05),而腸液總蛋白流量在第1天和第 2天采樣期內的平均流量差異不顯著(P＞0.05),但顯著地高于第 3天的平均流量(P＜0.05)。回腸腸液及腸液總蛋白流量 1 d內每小時的平均流量在 3 d采樣期內均無顯著差異(P＞0.05)。

3 討 論

3.1 腸道套管荷術雞適宜恢復期及應用時限的探討

腸道套管安裝過程需要依次切開皮膚層、肌膜、橫斜肌肉層、腹膜及氣囊膜,然后進入腹腔,并在背向腸系膜的一側做套管安裝切口。因此,整個術部的創傷較大。從國內外報道的雞、豬、牛等家畜腸道套管手術的術后恢復期上多規定為 2～21 d不等(表 5),但鮮見關于確定恢復期的依據。而在應用時限上,也鮮見關于套管瘺術雞、豬、牛術后可利用年限的詳細數據。本試驗中,荷術雞的術后恢復及應用時限主要從體況恢復、術后淘汰原因、采食量、精神狀態、羽毛、排泄物狀態與顏色方面進行考察。根據考察結果可發現,荷術雞經 20～25 d可恢復至術前的健康水平。在荷術雞的使用時限上,術雞經過 4個月的試驗后,體重在術前的基礎上顯著增加。同時,可保持 80%左右的術雞在經歷了“不同能蛋比飼糧對腸液組成成分影響的研究”的食糜采集試驗后仍保持健康體況。由此可見,腸道套管瘺術在雞小腸消化生理研究上的應用時限在 4個月以上。

表5 套管瘺術在畜禽消化生理研究中的應用Table 5 Application of cannulation in livestock and poultry

3.2 雞腸道中食糜及腸液流量的特性

成年蛋公雞的小腸全長 1.2～1.4 m,腸道沿縱向長度在組織形態、食糜停留時間、消化液分泌速度等方面都存在顯著差異。由此導致了腸道不同腸段的食糜及干物質流量、腸液及腸液總蛋白流量不僅沿腸道的縱向分布上存在差異,而且在晝夜節律上也有變異。本試驗中,十二指腸的食糜、食糜干物質、腸液流量都大大高于空腸和回腸的相應流量,這主要是由于沿著小腸縱向長度,攝入的飼糧逐漸被消化,飲水及內源性消化液也逐漸被吸收,從而使得十二指腸、空腸、回腸的食糜、食糜干物質及腸液流量依次降低。該結果與本研究組在前期試驗中觀察的結果[15]一致。在食糜的干物質含量上,通過套管收集到的十二指腸、空腸和回腸的食糜干物質含量分別為 6.9%、4.8%、4.3%(表 4),該結果與張鐵鷹[16]通過屠宰法獲取的肉仔雞十二指腸、空腸、回腸食糜的干物質含量約為 20%相比較有較大的差異,這可能與試驗方法及采樣部位有關。本試驗表明,在雞腸道不同位點食糜、食糜干物質、腸液及腸液總蛋白流量的日內變異及日間變異上,總體呈現白天流量大、夜間流量小的變異規律,而且在日間的平均流量上也存在差異。該結果與本實驗室前期在北京鴨腸液中主要消化酶活性晝夜及日間變異規律的結果[5]類似,這種晝夜變異的主要原因可能與自然光照、自由采食條件下雞的日采食量主要分布在白天有關[17-20]。而在不同采樣日間也存在某些差異,這可能是試驗動物每天的生理狀態存在某些差異,從而反映在食糜的特性上也存在日間差異,這一特性與大量消化試驗中豬、牛糞樣或腸道食糜樣品常規養分或指示劑濃度存在日間差異[21]類似。

4 結 論

①在雞十二指腸、空腸、回腸安裝套管術后25 d可恢復到術前體重,術后 120 d,試驗雞健康正常的比例分別達到 80%、76%和 81%。

②在自由采食、自然光照條件下,雞十二指腸、空腸、回腸在食糜、食糜干物質、腸液及腸液總蛋白流量上呈現白天流量大、夜間流量小的變異規律,日內變異系數在 6.28%～43.02%。在日間的平均流量上也存在顯著性差異,日間變異系數在 1.25%～16.40%。

[1] DIXON J M,WILKINSON W S.Surgical technique for the exteriorization of the uretres of the chicken[J].American Journal of Veterinary Research,1957,18:665-667.

[2] JOHNS D C,LOW C K,JAMES K A.Comparison of amino acid digestibility using the ileal digesta from growing chickens and cannulated adult cockerels[J].British Poultry Science,1986,27:679-685.

[3] 趙峰,張子儀,侯水生.鴨的空腸食糜連續采集方法及其空腸套管的設計[J].畜牧獸醫學報,2006,37(7):672-675.

[4] ZHAO F,HOU S S,ZHANG H F,et al.Effects of dietary metabolizable energy and crude protein content on the activities of digestive enzymes in jejunal fluid of peking ducks[J].Poultry Science,2007,86:1690-1695.

[5] 趙峰,張宏福,侯水生,等.鴨空腸液中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶活性變異的研究[J].畜牧獸醫學報,2008,39(5):601-607.

[6] SAS INSTITUTE.SAS/STAT user's guide[M].Cary,NC:SASInstitute Inc.,2004.

[7] BORGO G D,HARRISON P C,MCGINNIS J.A methord for cannulation of pancreatic ducts in young chicks[J].Poultry Science,1968,47:1818-1820.

[8] HULAN H W,MOREAU G,BIRD F H.A methord for cannulating the main pancreatic duct of chickens:the continuous collection of avian pancreatic juice[J].Poultry Science,1972,51:531-536.

[9] RAHARJO Y,FARRELL D J.A new biological method for determining amino acid digestibility in poultry feedstuffs using a simple cannula,and the influence of dietary fibre on endogenous amino acid output[J].Animal Feed Science and Technology,1984,12:29-45.

[10] GURNSEY M P,JAMES K A C.An improved methord of ileal cannulation of adult cockerels[J].Research in Veterinary Science,1985,39:390-391.

[11] KOMAREK R J.Intestinal cannulation of cattle and sheep with a T-shaped cannula designed for total digesta collection without externalizing digesta flow[J].Journal of Animal Science,1981,53:796-802.

[12] HORIGANE A,ARAKI T,HORIGANE A K,et al.Technical note:development of a duodenal cannula for sheep[J].Journal of Animal Science,1992,70:1216-1219.

[13] STEIN H H,SHIPLEY C F,EASTER RA.Technical note:a technique for insterting a T-cannula into the distal ileum of pregnant sows[J].Journal of Animal Science,1996,76:1433-1436.

[14] 趙峰.用酶法評定鴨飼料代謝能的方法學研究[D].博士學位論文.北京:中國農業科學院,2006.

[15] 趙峰,劉雨田,張宏福.飼糧蛋白質來源對蛋雞小腸液組成的影響[J].動物營養學報,2010,22(5):1279-1285.

[16] 張鐵鷹.植酸酶體外消化評定技術的研究[D].博士學位論文.北京:中國農業科學院,2002.

[17] SAVORY C J.Temporal control of feeding behaviour and its association with gastrointestinal function[J].Journal of Experimental Zoology,1999,283:339-347.

[18] BUYSEA J,ADELSOHNB D S,DECUYPEREA E,et al.Diurnal-nocturnal changes in food intake,gut storage of ingesta,food transit time and metabolism in growing broiler chickens:a model for temporal control of energy balance[J].British Poultry Science,1993,34:699-709.

[19] SAVORYC J.Effects of different lighting regimes on diurnal feeding patterns of the domestic fowl[J].British Poultry Science,1976,17:341-350.

[20] SAVORY C J.Broiler growth and feeding behaviour in three different lighting regimes[J].British Poultry Science,1976,17:557-560.

[21] 王和民,張子儀.畜禽飼養[M].合肥:安徽科學技術出版社,1987:33-38.