飼糧能量水平對烏金豬脂肪組織脂類合成代謝相關基因表達的影響

潘洪彬 趙素梅 黃 英 王 靜 張 曦 葛長榮 高士爭

烏金豬是云南省優良的地方豬種之一,具有耐粗飼、抗逆性強、肉質優良、肌內脂肪豐富等優良性狀[1]。研究不同能量水平的飼糧對烏金豬脂肪組織中脂類合成代謝和脂肪酸轉運基因表達的影響,對闡明飼糧能量水平對豬脂肪組織脂類代謝影響的分子機制具有重要科學意義。

動物體脂的沉積是一個復雜生理生化過程,受動物品種、年齡及營養狀態的影響較大。在脂肪合成過程中,乙酰輔酶 A羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)催化乙酰輔酶 A合成脂肪酸[2-4],是脂肪合成的限速酶[5-6]。固醇調節元件結合蛋白(sterol regulator element binding protein,SREBP)是一類膜結合轉錄因子[7],包括 SREBP-la、SREBP-lc和 SREBP-2 3種亞型,營養狀態改變可調節SREBP-1c表達[8]。脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白(adipocyte fatty acid-binding protein,A-FABP)與肌內脂肪含量、背膘厚及生長發育有關[9-10]。前期試驗中,本試驗室系統研究了飼糧不同能量水平對烏金豬生長、胴體組成和肉品質的影響,通過模糊綜合評定得出了烏金豬在不同生長階段獲得最佳肉品質的所需的飼糧能量水平[11-12],并研究了飼糧蛋白質對豬的脂肪組織中脂類代謝相關基因表達的影響[13]。本試驗在此基礎上,進一步深入研究飼糧不同能量水平對烏金豬脂肪組織脂類合成代謝相關基因表達的影響,闡明飼糧能量水平對豬脂肪組織脂類合成代謝影響的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試驗設計

選取健康、胎次相近、體重約 15 kg的烏金豬54頭,公母各占 1/2,采用單因子隨機分組分為 3組,每組 3個重復,每個重復 6頭豬,分別飼喂 3種不同消化能水平的飼糧。

根據《動物營養參數與飼養標準:中國肉脂型生長肥育豬飼養標準》[14]設計烏金豬各生長階段飼糧,每階段飼糧粗蛋白質等營養水平基本一致,設低(LDE)、中 (MDE)、高(HDE)3個消化能水平,中能組飼糧采用飼養標準的消化能,低、高能組飼糧則分別上下調整 10%,消化能分別為低能組 11.74 MJ/kg、中能組 12.89 MJ/kg、高能組14.22 MJ/kg[11-12]。試驗飼糧組成及營養水平見表1。

1.2 飼養管理

試驗分 15～30、30～60和 60～100 kg 3個階段。預試期為 5 d,試驗期日飼喂 3次,自由飲水,注意觀察豬的精神狀態和行為等,各階段換料采用逐漸過渡方法,過渡期為 7 d。分別于 30、60和100 kg體重時分批屠宰,每批屠宰 6頭,測定胴體脂肪率,并取皮下脂肪組織于 -80℃保存待測。

表1 試驗飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis)

1.3 實時定量 PCR(real-time PCR)

1.3.1 總 RNA提取

用 Trizol試劑提取總 RNA,用紫外分光光度計(260 nm)和變性瓊脂糖凝膠電泳測定總 RNA濃度與純度。

1.3.2 反轉錄

取 2μg總 RNA進行反轉錄,反應采用 20μL體系:12μmol/L隨機引物、0.5 mmol/L dNTP、20 U/μL RNA酶 抑 制 劑 (RNase inhibitor)、10 U/μL反轉錄酶(M-MLV RTase)、4μL 5×RT Buffer[含 250 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、50 mmol/L MgCl2、 250 mmol/L KCl、50 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)、2.5 mmol/L亞精胺(Spermidine)]。先加 RNA模板、dNTP和隨機引物,70℃變性 5 min,立即冷卻,再加其余試劑 37℃反應60 min,95℃滅活 5 min。反轉錄產物于 -20℃保存備用。

1.3.3 實時定量 PCR

目的基因(ACC、FAS、SREBP-1c、A-FABP)和內標基因 β-肌動蛋白(β-actin)引物使用 Primer v5軟件根據 GenBank上豬的基因序列設計,引物序列、退火溫度、產物大小及登錄號見表 2。

表2 實時定量PCR特異性引物Table 2 Specific primers for real-time PCR

實時定量 PCR采用 20μL反應體系:1.5μL反轉錄產物、10μL iQTMSYBRGreen Supermix(BIO-RAD,美 國 )、 0.25 mmol/μL dNTP、0.5 mmol/L目的基因引物。每個樣品測定 2次,2個平行樣間的相對偏差不大于 10%。各基因 PCR的優化條件見表 3。

表3 實時定量 PCR條件Table 3 Conditions for real-time PCR

1.3.4 定量方法

實時定量 PCR結果以表達量的倍數表示,基因表達量根據下列公式計算[15]。

式中,CT為閾值循環。

1.4 數據分析

采用 SAS 9.0軟件對試驗數據進行統計分析,對平均值進行方差分析,做顯著性檢驗(P＜0.05、P＜0.01)。

2 結 果

2.1 飼糧能量水平對不同生長階段烏金豬脂肪率的影響

由表 4可知,不同能量水平的飼糧對 30 kg烏金豬脂肪率影響不顯著(P＞0.05),而對 60和100 kg的烏金豬的脂肪率有極顯著影響(P＜0.01),高能組烏金豬的脂肪率比低能組的分別高8.39%和 19.25%,且烏金豬脂肪率隨飼糧能量水平的升高呈現升高趨勢。

表4 不同生長階段飼喂不同能量水平飼糧的烏金豬的脂肪率Table 4 Fat percentage of Wujin pigs feed diets with different energy levels at different growth stage %

2.2 飼糧能量水平對不同生長階段烏金豬 ACC表達水平的影響

由表 5可知,體重為 30 kg時,中、高能組脂肪組織 ACC表達水平分別比低能組降低了65.00%、78.00%(P＜0.05),體重為 60 kg時,分別提高了 4.73%(P＞0.05)和 24.54%(P＜0.05),體重為 100 kg時,分別降低了 3.43%(P＞0.05)和32.31%(P＜0.05)。此外,體重為 60 kg時,脂肪組織 ACC基因的表達水平高于體重為 30和100 kg時。

表5 不同生長階段飼喂不同能量水平飼糧的烏金豬脂肪組織ACC表達水平Table 5 The expression level of ACC in adipose tissue of Wujin pigs feed diets with different energy levels at different growth stage

2.3 飼糧能量水平對不同生長階段烏金豬 FAS表達水平的影響

由表 6可知,60 kg體重時,脂肪組織 FAS表達水平隨飼糧能量水平升高而升高,中、高能組分別比低能組的升高了 79.56%和 227.73%(P＜0.05);在 30和 100 kg體重時則相反,FAS表達水平隨飼糧水平的升高而降低,中能組比低能組的分別降低 11.00%和 3.92%(P＞0.05);高能組比低能組分別降低了 65.00%和 38.24%(P＜0.05)。此外,60 kg體重時,脂肪組織 FAS基因的表達水平比 30和 100 kg體重時高。

表6 不同生長階段飼喂不同能量水平飼糧的烏金豬脂肪組織 FAS表達水平Table 6 The expression level of FAS in adipose tissue of Wujin pigs feed diets with different energy levels at different growth stage

2.4 飼糧能量水平對不同生長階段烏金豬SREBP-1c表達水平的影響

由表 7可知,高能組與低、中能組脂肪組織SREBP-1c基因表達水平差異顯著(P＜0.05);體重為 60 kg時,脂肪組織 SREBP-1c表達水平隨飼糧能量水平的升高而升高,高能組與中能組相比顯著上調 62.07%(P＜0.05);體重為 30和100 kg時,SREBP-1c表達水平隨飼糧能量水平的升高而降低,中能組比低能組分別降低 5.00%和3.03%,高能組比低能組分別降低 45.00%和 24.24%。并且,體重為 60 kg時,脂肪組織 SREBP-1c表達水平比 30和 100 kg體重時高。

表7 不同生長階段飼喂不同能量水平飼糧的烏金豬脂肪組織 SREBP-1c表達水平Table 7 The expression level of SREBP-1c in adipose tissue of Wujin pigs feed diets with different energy levels at different growth stage

2.5 飼糧能量水平對不同生長階段烏金豬A-FABP表達水平的影響

由表 8可知,隨著飼糧能量水平的升高,30和100 kg體重時脂肪組織 A-FABP表達水平逐漸升高,中能組分別比低能組顯著升高 119.00%和65.00%(P＜0.05),高能組分別比低能組顯著升高 339.00%和 120.00%(P＜0.05);體重為60 kg時,A-FABP表達水平隨飼糧能量水平的升高而降低,中、高能組分別比低能組顯著降低了 20.45%和 67.05%(P＜0.05)。此外,隨著體重的增加,除高能組外各組 A-FABP表達有逐漸下降的趨勢。

表8 不同生長階段飼喂不同能量水平飼糧的烏金豬脂肪組織 A-FABP表達水平Table 8 The expression level of A-FABPin adipose tissue of Wujin pigs feed diets with different energy levels at different growth stage

3 討 論

動物每天從食物中攝取能量,并主要在肝臟和脂肪組織中把多余的能量轉變成脂肪儲存起來。能量供給水平與畜禽的生產性能和胴體品質有密切關系,一般來說,畜禽攝取能量越多,日增重越快,飼料利用率越高,胴體脂肪含量也越多。研究表明,提高飼糧能量水平可促進生長,同時又增加體脂含量[15-17],劉作華等[18]研究也表明飼糧能量水平影響豬生產性能及體脂沉積。本試驗結果表明,不同生長階段的烏金豬脂肪率隨飼糧能量水平的升高而升高,與上述研究結果相一致。

中國地方豬種與國外其他商品豬種相比,表現生長速度慢、脂肪沉積率高[19-22]。脂肪沉積主要與脂肪組織的脂肪生成能力有關,脂肪組織是脂肪酸合成的主要部位[23],脂肪和肌肉組織中甘油三酯的數量是脂肪合成和降解的綜合體現。熊文中等[24]研究發現,豬脂肪組織中脂肪酸合成酶與胴體脂肪量、胴體的脂肪率呈極顯著正相關。另外,動物脂肪的水解主要靠激素敏感脂酶催化水解,這些酶是脂肪細胞中甘油三酯降解的限速酶,在調控能量平衡中起重要作用[25]。

ACC是脂肪酸從頭合成過程中的關鍵酶[2],它調節脂肪酸合成以及脂肪酸的 β氧化,營養因素對 ACC活性及其 mRNA水平的調控具有組織特異性,ACC在脂肪型豬體內的活性是瘦肉型豬的 3倍,它與基礎脂肪的合成率呈正相關[20];FAS是一個多酶復合體系,它利用丙二酸單酰輔酶 A合成長鏈脂肪酸棕櫚酸[5],FAS基因的表達增加能顯著促進甘油三酯的沉積從而導致肥胖[26]。劉作華等[18]研究表明能量水平可通過影響 FAS的表達來調節豬的脂肪沉積。此外,ACC和 FAS對脂肪的合成起到限速性和決定性的作用[5-6]。SREBP-1c是一類與膜結合的轉錄因子,它們能夠激活編碼膽固醇和脂肪酸生物合成的酶基因,這些酶包括 ACC、FAS、硬脂酰輔酶 A去飽和酶、甘油 -3-磷酸乙酰轉移酶等[27-28]。本試驗結果表明,高能量飼糧顯著促進 60 kg體重烏金豬脂肪組織中 ACC、FAS和 SREBP-1c基因的相對表達,脂肪合成相關的基因表達受到上調,說明 60 kg烏金豬脂肪組織中的游離脂肪酸從頭合成有所增加,相反高能量飼糧卻顯著抑制 30和 100 kg體重烏金豬脂肪組織中 ACC、FAS和 SREBP-1c基因的表達,間接說明高能量飼糧降低了烏金豬生長早期和后期的脂肪組織中脂肪酸的從頭合成。

脂肪組織中 A-FABP負責將脂肪細胞的脂肪酸運送至脂肪酸氧化或三酰甘油合成的位置[29],防止細胞內堆積過多的游離脂肪酸,并維持脂肪細胞脂解和脂肪合成之間代謝的動態平衡[30]。本試驗結果表明,高能量飼糧促進了 100 kg體重烏金豬 A-FABP的基因表達,并且 100 kg體重時烏金豬胴體脂肪率明顯高于其他體重階段,說明脂肪酸的轉運增強,脂肪組織攝取較多的游離脂肪酸,脂肪合成能力增強;而 30 kg體重烏金豬的A-FABP的基因表達增強,也許是生長早期需要儲備一定量的脂肪以利于中后期的生長;高能量飼糧抑制 60 kg體重烏金豬脂肪組織 A-FABP基因表達,說明脂肪組織對外源脂肪酸的利用減少,即分解利用的脂肪酸減少,而體內從頭合成的脂肪酸增加;從烏金豬脂肪率隨飼糧能量水平升高而升高的趨勢來看,烏金豬機體隨能量水平的升高可能儲存了更多的脂肪酸,即高能量飼糧能增加脂肪組織中的脂肪酸含量。

因此,烏金豬在不同生長階段,飼糧能量水平對脂肪組織的脂肪代謝可能存在不同的調控機制,在生長早期和后期(30和 100 kg),飼糧高能量抑制了脂肪組織中脂肪酸的從頭合成,但高能量水平卻能增加脂肪組織的脂肪沉積[15-17],說明高能量營養有可能通過其他脂類合成途徑合成脂肪,增加脂肪沉積,本試驗結果也證實了此時脂肪酸的轉運增加,說明脂肪組織攝取了較多的外源脂肪酸來合成脂肪,可能通過二脂酰甘油酰基轉移酶(DGAT)來對外源脂肪酸加以利用,合成甘油三酯[31]。而生長中期(60 kg)的情況有所不同,此時是體組織合成的旺盛時期,機體蛋白質及脂類代謝都較強,高能量營養同時增強了脂肪酸的從頭合成代謝以滿足機體快速生長及沉積脂肪的要求。

4 結 論

①體重為 60和 100 kg時,烏金豬脂肪率隨飼糧能量水平的升高而極顯著升高。

②高能量飼糧顯著促進烏金豬脂肪組織脂類合成代謝相關基因(ACC、FAS、SREBP-1c)在體重60 kg時的表達,可能增加了 60 kg體重烏金豬脂肪組織中游離脂肪酸的從頭合成。

③高能飼糧顯著抑制脂肪酸轉運相關基因(A-FABP)在 60 kg時的表達,降低了脂肪酸轉運,可能減少了脂肪組織對外源脂肪酸的攝取。

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