蛹蟲草菌絲體液體培養工藝的研究

房天琪， 邱芳萍， 王長周， 季曉楓

(長春工業大學化學與生命科學學院，吉林長春 130012)

0 引 言

蛹蟲草(Cordyceps militaris)又名北冬蟲夏草、北蟲草等，是著名的食藥用菌，具有較高的食藥用價值[1]，近年來，隨著野生冬蟲夏草資源逐漸枯竭，價格不斷上漲，人們把目光瞄準了用人工培育的蛹蟲草作為冬蟲夏草的替代品[2]。有研究表明，人工培育蛹蟲草的菌絲體和子實體具有相似的藥用與滋補功效[3]。因此，采用液體發酵獲得的菌絲體代替子實體生產各種藥用和保鍵產品成為目前冬蟲夏草市場亟待解決的問題[4]。本研究通過響應面分析法與PB實驗相結合的方法，以菌絲體生長量為響應值[5]，采用多元二次回歸擬合方程[6]，并通過求偏導獲得了主要影響因子的最佳濃度配比[7]。蛹蟲草液體培養進行優化試驗研究，對蟲草產業發展具有一定的理論與實際意義[8]。

1 實驗材料

1.1 菌種

蛹蟲草菌(Cordycepsm ilitaris)，由吉林蠶業研究所提供。

1.2 斜面培養基組成

每1 L培養基中含有:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨 20 g，KH 2 PO4 1.0 g，MgSO4?7H 2O 0.5 g，瓊脂20 g，pH自然。

1.3 種子培養基

每1 L培養基中含:土豆200 g，胡蘿卜200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，KH2PO41.0 g，MgSO4?7H 2O 1.0 g，維生素B1 1.0 g。

1.4 試劑

其它試劑均為分析純，長春金星化學與生物制劑有限公司購買。

2 實驗方法

2.1 培養方法

將制備的供試液體培養基各取100 m L，分別裝入250m L的三角瓶中，經高壓蒸汽滅菌，在無菌操作臺上接入1塊0.5 cm2菌種塊，放入恒溫振蕩培養箱中，在25℃，150 r/min的條件下振蕩培養3 d，得到帶有菌絲體球的種子液，以一定接種量轉接至發酵培養液中，相同條件下培養2 d，得發酵液。

2.2 菌絲體生長量的測定

將發酵液中的菌絲體放于離心機中離心，轉速設定為4 000 r/m in，時間15min，棄上清液，以去離子水洗滌沉淀3次，干燥至恒重，即得菌絲體干重。

2.3 Placket t2Burman(PB)設計

通過預實驗(碳源考察和氮源考察)選擇對蛹蟲草菌絲體干重有正效應的影響因素，對培養基成分及培養條件進行考察，篩選影響蟲草菌絲體產量的重要因素，確定最優培養基及最適培養條件，其試驗因素、水平見表1。

表1 PB試驗因素與水平 (g/L)

試驗設計、數據分析和模型建立皆由M ini Tab 16輔助完成。

2.4 中心組合設計和響應面分析

根據Box2W il son的中心組合設計原理，以最陡爬坡試驗得到的中心點，對PB試驗確定的顯著因素安排響應面分析試驗。試驗設計、數據分析和模型建立皆由Design-Expert 7.0.0輔助完成。

2.5 生長曲線的測定

采用比濁法測定蟲草菌的生長曲線，以發酵時間與OD600之間的關系繪制菌絲體生長曲線。

3 結果與分析

3.1 蛹蟲草液體培養基最佳碳源以及氮源的確定

圖1 蛹蟲草液體培養最佳碳源的選擇

蛹蟲草液體培養基最佳碳源以及氮源的選擇分別如圖1和圖2所示。由圖1和圖2可知，以蛹蟲草菌絲體干重為指標，確定最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為玉米漿。

3.2 PB試驗結果

圖2 蛹蟲草液體培養最佳氮源的選擇

通過PB試驗設計方案，用M initab軟件對試驗數據進行分析，得到各因素對響應值Y(菌絲體干重，g/L)的影響效果見表2。

表2 因素影響效果分析

同時得到一次回歸方程為:

根據表2中的檢驗結果可知，在99%置信區間內，葡萄糖和玉米漿的可信度分別為99.33%和99.48%，該方程的決定系數R2為98.20%，表明該回歸方程擬合良好，可應用于分析和預測發酵過程中蛹蟲草菌絲體的產量。

3.3 中心組合設計和響應面分析

響應值維持原始水平不變，根據爬坡試驗得到的中心點，對X1，X2，X3，X7進行中心試驗組合設計。為使擬合方程具有旋轉性和通用性，中心點重復5次，星號臂長γ=1.414。通過自變量水平及編碼試驗設計結果，再利用Design-Expert中的響應面回歸命令對實驗數據進行分析，得到二次回歸方程各因子的偏回歸系數估計值及方差分析結果見表3。

表3 回歸方程中回歸系數的估計值及方差分析

續表3

由表3得到預測菌絲體生物量的回歸方程，對回歸方程各項進行方差分析可知，回歸方程中包含6個顯著項:A，C，D，AC，BC，CD，A2，B2，D2這9個顯著項的Pr＞|t|的概率均小于0.05，得出該方程的相關系數R=0.982 0，說明該方程回歸效果顯著，模型可信度高，試驗因子對響應值的影響可用回歸方程表示為:

響應面分析法(X1，X2，X3，X7)立體分析圖和相應的等高線圖如圖3所示。

圖3 響應面分析法(X 1，X 2，X3，X7)立體分析圖和相應的等高線圖

圖3表明，在所選因素水平范圍內，均有最大響應值出現，通過數學模型預測最優的培養條件為:葡萄糖濃度 23.34 g/L，玉米漿濃度25.5 m L/L，接菌量9%，發酵溫度25℃的條件下，菌絲體生物量最大預測值為15.59 g/L。為了檢驗模型的準確性，對此進行驗證試驗，共進行3批次重復試驗，得到菌絲體生物量的平均值為15.56 g/L，可見該模型能很好地預測蟲草發酵情況。

3.4 測定最佳培養條件下蛹蟲草生長曲線

對最佳種子培養基進行菌種的培養，每隔2 h取樣品測定發酵液中的菌體量，以時間與菌體量繪制生長曲線，如圖4所示。

圖4 蛹蟲草生長曲線

從圖4可以看出，菌種接入種子培養基0～28 h后，開始由生長延滯期進入對數生長期，72 h菌量達到最高峰，120 h后，細胞量開始下降后，進入靜止期。因此，接種種齡取72 h為宜。

4 結 語

試驗表明，在所選的碳源中，葡萄糖最有利于蛹蟲草菌絲體的生長，玉米漿與無機氮源相比更易被蟲草菌絲體利用，通過PB實驗設計確立了最顯著影響因素分別為葡萄糖濃度、玉米漿濃度、接種量、培養時間，并通過響應面軟件建立這4個因素和響應值菌絲體生物量之間的數學模型，效果顯著，能很好地預測菌絲體的生物量。通過驗證試驗，在響應面優化后所獲得的實際值與預測值的最大響應值間擬合程度良好，表明中心組合設計和響應面分析法在培養基優化方面的應用具有實際指導意義。

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