利用正交設計優(yōu)化甘蔗SRAP-PCR反應體系

昝逢剛，劉家勇，趙俊，趙培方，吳轉娣，吳才文

（云南省農業(yè)科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，開遠616600）

利用正交設計優(yōu)化甘蔗SRAP-PCR反應體系

昝逢剛，劉家勇，趙俊，趙培方，吳轉娣，吳才文

（云南省農業(yè)科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，開遠616600）

利用正交設計L16（45）對甘蔗SRAP-PCR反應體系的五大因素（Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA、Taq酶）在4個水平上進行優(yōu)化，得到如下結論：各因素水平變化對PCR反應的影響從大到小依次是：Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA；通過對各因素進行篩選，建立甘蔗SRAP-PCR反應的最佳體系（20μL）為：dNTPs 0.25 mmol/L、引物0.1μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、Taq酶0.25U和模板DNA 60 ng。

甘蔗；SRAP-PCR；正交設計；優(yōu)化

甘蔗是我國最重要的糖料作物，同時也是重要的能源植物。隨著甘蔗育種工作和基因工程研究的不斷深入，分子標記技術已成為甘蔗育種工作中的重要輔助工具。目前，甘蔗育種主要通過常規(guī)雜交的方法，根據分離群體的形態(tài)表現(xiàn)和育種工作者的經驗等對優(yōu)良個體進行選育。然而甘蔗的主要工農藝性狀較多地表現(xiàn)為數量性狀，數量性狀受多基因控制，且數量性狀及控制數量性狀基因的表達受外界環(huán)境因素的影響較大，發(fā)現(xiàn)與目標基因相連鎖的形態(tài)標記深受困惑。將分子標記技術應用到甘蔗育種中，利用分子標記與決定目標性狀基因緊密連鎖的特點，開展遺傳圖譜構建、基因定位與克隆、比較基因組學、cDNA指紋圖譜、生物多樣性分析、預測雜種優(yōu)勢等，從而達到選擇目標性狀的目的，具有準確、快速、不受環(huán)境條件干擾的優(yōu)點。分子標記技術已在許多作物的育種工作中獲得了成功的應用。

相關系列擴增多態(tài)性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是一種新型的基于PCR的標記系統(tǒng)，由美國加州大學蔬菜作物系Li與Quiros博士（2001）提出，又叫基于序列擴增多態(tài)性（Sequence-based amplified polymorphism，SBAP）（Ferriol et al.，2003）。SRAP分子標記系統(tǒng)最早在蕓薹屬作物開發(fā)出來，目前已在水稻、蘋果、棉花和芹菜等多種植物中成功擴增，并應用于遺傳圖譜構建（柳李旺，2004）、比較基因組學（Li G.Gao et al.，2003；于拴倉等，2005）、遺傳多樣性分析（Ferriol et al.，2003；昝逢剛等，2009）。SRAP標記擴增結果易受dNTPs、引物、Mg2+、Taq酶和模板DNA等因子的影響，且不同物種選用引物和反應體系也不相同，所以對反應體系的優(yōu)化是必要的。為此，本研究對甘蔗SRAP技術體系中各影響因素進行正交試驗，旨在探討SRAP分析技術的最佳方案，為下一步甘蔗的SRAP標記分析研究奠定必要的技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選用材料為ROC22號，2010年9月采自云南省農業(yè)科學院甘蔗研究所所內試驗基地。用于SRAP-PCR反應的Mg2+、Taq酶和dNTPs購自TaKaRa公司，SRAP引物由上海生工合成，經篩選引物（me3和em3）作為本次試驗引物，正向引物me3序列：TGAGTCCAAACCGGAAT；反向引物em3序列：GACTGCGTACGAATTGAC。

1.2 甘蔗基因組DNA模板的提取與檢測

甘蔗總DNA提取采用CTAB法稍加改良，紫外分光光度計及1%瓊脂糖凝膠檢測其濃度和純度，并稀釋到20 ng/μL備用。

表1 PCR反應的因素水平體系終濃度

1.3 SRAP-PCR反應因素水平的確定與正交表設計

為確定PCR反應中各因素最佳水平，采用正交設計L16（45）進行試驗。PCR各因素水平見表1。正交試驗中16個處理3次重復，總反應體系為20μL，反應程序參照Li與Quiros（2001）的程序，略有改動：94℃預變性5min，94℃變性1 min，35℃復性1 min，72℃延伸1.5 min，5個循環(huán)；94℃變性1 min，50℃復性1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR擴增產物用5%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

2 結果與分析

2.1 電泳結果評分

按表2設計的16個處理進行PCR試驗，電泳檢測結果如圖1所示，根據電泳條帶的多少、清晰度及背景顏色進行打分。條帶豐富、清晰度高、背景顏色淺的記16分，相反的記1分（謝運海等，2005）。對3次重復分別進行統(tǒng)計，得分見表2，從結果看一致性較好。取3次得分平均值進行直觀分析：求各列各水平的和T1、T2、T3、T4；由于各列各水平均重復了4次，可由和求出各水平的均值；用各列最大均值減去最小均值得各列極差R。R越大，說明該因素對指標影響越大。分析極差R可知，各因素水平變化對PCR反應影響從大到小依次是：Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA。

2.2 因子濃度對PCR結果的影響

2.2.1 dNTPs濃度對PCR結果的影響底物dNTPs濃度過高，會導致聚合酶錯誤的滲入，濃度過低則會影響合成的效率。如圖2所示，dNTPs濃度在0.15～0.25mmol/L時差異顯著，結果均值在上升；在0.25～0.3mmol/L水平間差異不顯著，均得到較好的效果，最終確定0.25mmol/L為最佳反應水平。

2.2.2 引物濃度對PCR結果的影響引物過多會產生錯誤引導或產生引物二聚體，引物過低則降低產量。如圖3所示，0.1μmol/L與0.3μmol/L、0.2μmol/L與0.3μmol/L在水平上差異不顯著，0.1μmol/L與0.2μmol/L、0.1μmol/L與0.4μmol/L在水平上差異顯著。最終確定0.1μmol/L為最佳反應水平。

2.2.3 Mg2+濃度對PCR結果的影響較高的Mg2+濃度可增加產量，但也會增加非特異性擴增。濃度過低則會降低Taq酶的活性，反應產物減少。如圖4所示，Mg2+濃度從1.5mmol/L到3mmol/L過程中，結果均值一直在增加。2.5mmol/L與3mmol/L水平結果均值差異不顯著，其余每二者間的差異均達到顯著水平。最終確定2.5mmol/L為最佳反應水平。

2.2.4 Taq酶濃度對PCR結果的影響一般說來，酶量過多會使產物非特異性增加，過少則使產量降低。如圖5所示，0.25～0.75U結果均值略有下降，0.75～1U略有上升，但在水平間差異都不顯著。從節(jié)約的角度考慮，最終確定0.25U為最佳反應水平。

表2 PCR反應的因素水平L16（45）正交試驗設計

圖1 PCR產物電泳結果

圖2 dNTPs濃度與結果均值的關系

圖3 引物濃度與結果均值的關系

圖4 Mg2+濃度與結果均值的關系

圖5 Taq濃度與結果均值的關系

圖6 模板DNA濃度與結果均值的關系

2.2.5 模板DNA濃度對PCR結果的影響模板DNA濃度過低，會導致擴增結果不穩(wěn)定及擴增條帶模糊；濃度過高，則可能底物過量擴增，擴增結果不穩(wěn)定的現(xiàn)象。如圖6所示，20ng到80ng擴增結果在水平上無明顯差異，選擇效果較理想的60ng作為模板的優(yōu)化濃度。

3 討論

SRAP標記是一種新型的基于PCR的標記技術，它針對基因外顯子區(qū)GC含量豐富而啟動子、內含子區(qū)AT含量豐富的特點設計引物對ORFs（open reading frames，開放閱讀框）進行擴增，因不同個體的內含子、啟動子與間隔區(qū)長度不等而產生多態(tài)性，具有簡便、穩(wěn)定、共顯性、多態(tài)性高、中等產率、引物具有通用性和比較容易地分離目的標記并測序等特點。

SRAP標記技術基于PCR反應，反應條件、擴增程序變化和不同作物都會有不同的影響。本試驗結果證明，采用不同PCR體系和不同擴增程序對甘蔗的SRAP-PCR擴增結果影響較大。正交試驗結果分析，得出了甘蔗SRAP-PCR反應最佳體系。20μL反應體系包括：dNTPs 0.25mmol/L，引物0.1μmol/L，Mg2+2.5mmol/L，Taq酶0.25U，模板DNA 60ng。優(yōu)化體系結果與正交實驗中最好的第12個體系較為接近。

本試驗對甘蔗SRAP體系優(yōu)化采用正交試驗設計與分析，使結果更加科學可靠，結果具有一定的客觀準確性。但在依據條帶打分過程中存在一定主觀成分和誤差。相信SRAP技術在甘蔗遺傳多樣性、品種鑒定、遺傳圖譜構建及其它方面必定具有更加廣闊的應用前景。

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Optimization for Sugarcane SRAP-PCR System by Orthogonal Design

ZAN Feng-gang，LIU Jia-yong，ZHAO Jun，ZHAO Pei-fang，WU Zhuan-di，WU Cai-wen
（Yunnan Province Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement/Sugarcane Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kuaiyuan 616600，China）

The orthogonal design was used to optimize SRAP-PCR amplification system on sugarcane in four levels of five factor（Mg2+，dNTPs，Taq DNA polymerase，primer and the DNA template），respectively.The result of PCR showed that the effect of each factor in different levels in the order from big to small was Mg2+，dNTPs，primer，Taq DNA polymerase and the DNA template.A most suitable SRAP-PCR system for sugarcane was established，the system of 20μl reaction contained 0.25 mmol/L dNTPs，0.1μmol/L primer，2.5 mmol/L Mg2+，0.25U Taq DNA polymerase and 60 ng DNA template.

sugarcane；SRAP；orthogonal design；optimization

S566.101

A

1007-2624（2011）03-0006-03

2011-02-21

現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金（nycytx-024-01-03）；云南省“十一五”科技攻關（2006NG11）。

昝逢剛（1979-），男，云南省楚雄州人，碩士。研究方向：甘蔗遺傳育種。E-mail:fengang88@126.com

吳才文（1963-），男，研究員。研究方向：甘蔗遺傳育種。E-mail:gksky_wcw@163.com