甜菜堿的電噴霧質譜研究

王佳鈺 ，張婷婷 ，許慶軒 ，孫 暉 ，周 芹 ，吳玉梅

（1.農業部甜菜品質監督檢驗測試中心，哈爾濱150080；2黑龍江中醫藥大學藥學院，哈爾濱150040）

甜菜堿在甜菜糖蜜中首先發現并因此得名。它是一種高效甲基供體，能調節體內滲透壓、促進脂肪代謝和蛋白質合成。由于對動物生長有多種作用[1－2]，因此主要應用于飼料。另外，甜菜堿具有多種藥理作用[3－4]，在醫藥行業也有廣闊的前景。甜菜堿的檢測主要有分光光度法[5－6]和高效液相色譜法[7－8]。但是分光光度法定性能力較差，甜菜堿的紫外吸收波長較小（在192nm處最大吸收），容易受雜質及溶劑干擾。高效液相色譜法對前處理要求較高，工作費時費力。電噴霧質譜技術不需要復雜的前處理，在生物及天然產物分析中有著廣泛的應用[9-12]，生物堿一般具有堿性和高質子親核勢，在電噴霧質譜中容易電離，因此具有很好的靈敏度和重現性，串聯質譜給出化合物的結構信息，大大提高了定性能力[13-16]。

甜菜堿又稱三甲基甘氨酸，系一種季胺型生物堿，分子中含有一個羧基和一個氨基，因此甜菜堿具有很高的質子親核勢，適合在正離子模式下檢測。本文采用簡單的前處理方法獲得糖甜菜提取液，使用電噴霧質譜法很容易獲得其正離子模式的質譜圖，在其中選擇與甜菜堿質核比相同的質譜峰碰撞誘導解離，將其與甜菜堿標準品的串聯質譜進行對照，就可以很方便地鑒定出甜菜堿。本方法不需要復雜的前處理，具有很高的靈敏度和重現性，串聯質譜給出的結構信息可以對甜菜堿定性，因此本方法可以作為復雜體系中甜菜堿的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

實驗材料：糖甜菜塊根，栽培品種，由中國農科院甜菜研究所提供。

儀器設備：電噴霧質譜儀為ThermoFisher LCQ fleet（Thermo Fisher Scientific公司），氦氣為緩沖氣和碰撞氣，使用電噴霧源，正離子模式。儀器條件優化如下：鞘氣（sheath gas，氮氣）流速：30arbitrary units；噴霧電壓（ion spray voltage）：4.0kV；毛細管溫度（capillary temperature）：180℃；毛細管電壓（capillary voltage）：44V；套管透鏡補償電壓（tube lens offset）：50V；注射泵（syringe pump）進樣，進樣速度為 5μL/min；碰撞能量 25%。

主要試劑為甲醇（色譜級，迪馬公司），去離子水（Milli-Q純水機制備），甜菜堿標準品購于SIGMA公司，甲酸、氨水均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 甜菜堿的電噴霧質譜研究 a）甜菜堿電噴霧質譜分析條件的研究：將甜菜堿標準品分別溶解于甲醇/水（50∶50），甲醇/水/甲酸（50∶50∶0.5），甲醇/水/氨（50∶50∶0.5）中制成 0.0001%的甜菜堿溶液，將此溶液用于電噴霧質譜檢測，注射泵流速5μL/min。b）甜菜堿電噴霧串聯質譜研究：根據1.2.1中a）實驗選擇合適的甜菜堿電噴霧檢測條件，用于串聯質譜研究，優化能量，使串聯質譜處于最佳狀態。

1.2.2 糖甜菜中甜菜堿的檢測 取糖甜菜鮮樣使用鋸糊機制成糊狀，取10g甜菜糊分別用30mL水提取2次，合并提取液過濾，加入60mL甲醇攪拌，靜止1h，過濾，加入甲酸配成0.5%甲酸溶液，直接用于電噴霧質譜分析，并選擇與甜菜堿相同質核比的峰進行串聯質譜研究。

2 結果與討論

甜菜堿在電噴霧負離子模式下沒有信號，但是在正離子模式下信號很強。圖1展示了甜菜堿在中性、堿性、酸性溶液的正離子電噴霧質譜。通常生物堿的質子親核勢較高，在電噴霧條件下容易形成質子化分子。圖 1a 中，我們可以看出，在中性條件下，甜菜堿極易出現[M+H]+（m/z118）峰、[M+Na]+（m/z140）峰和[M+K]+（m/z156）峰，同時也會產生聚合現象，其聚合物也以加H、Na、K峰的形式出現。從總的趨勢來看，這些峰的強度呈現正態分布，也就是隨著聚合度的增加其強度也增加，在四聚體的情況下達到最強，之后隨聚合度增加峰的強度呈現出逐漸降低的趨勢。說明甜菜堿在中性條件容易聚合，四聚體處于空間結構最穩定狀態，在這個區間聚合物只要表現為電荷吸引作用，空間排斥效應較小，之后隨著聚合度的增加空間排斥效應逐漸變大，其穩定性逐漸降低，因此峰強度逐漸減弱。另外，甜菜堿加H、Na、K峰的強度表現為加H峰>加Na峰>加K峰，說明甜菜堿及其聚合物容易和半徑小的離子結合。但是在四聚體的情況下加Na峰最強，說明鈉離子半徑適當，在四聚的情況下空間位阻最小。在通常情況下，堿性條件能夠抑制正離子，因此不利于電噴霧正離子的形成。如圖1b所示在堿性條件下，加Na及加K離子受到嚴重抑制，但是加H峰仍然很強，說明甜菜堿的質子親核勢很強，堿性條件對電噴霧質譜加氫離子抑制有限。在堿性條件下甜菜堿也存在聚合現象，但是這種聚合能力與中性條件下相比大大降低，并且聚合度越高穩定性也越差，峰的強度也隨之降低。同樣在酸性條件下，也只出現了[M+H]+峰（如圖1c所示），這是由于氫離子的含量增多，競爭甜菜堿的能力大大高于鈉、鉀離子導致的。在堿性條件下氫氧根離子與甜菜堿共同競爭陽離子從而導致加甜菜堿加Na及加K離子消失，這就是在酸性和堿性條件下甜菜堿離子化的差別。另外，在酸性條件下，甜菜堿聚合物的強度很小，說明酸性條件嚴重影響甜菜堿的聚合。甜菜堿是兩性化合物，含有酸堿兩個活性集團，在中性條件下含有正、負電荷的兩個活性位點，在酸性或堿性條件下只存在一個活性位點，在酸、堿條件下甜菜堿聚合能力降低，說明甜菜堿分子之間的聚合是由兩個活性位點的正、負電荷相互吸引導致的。另外，這種聚合物的穩定性與甜菜堿的聚合度以及加和離子的大小也有很大關系（如圖1a所示），說明空間效應對聚合有很大影響，也證明了這種聚合是非線型的，環型聚合的可能性最大。

選擇甜菜堿的加氫離子（m/z118）做串聯質譜，譜圖如圖2所示，在二級串聯質譜中，m/z118的母離子丟失60、59Da的中性碎片，分別產生m/z58、59的子離子，甜菜堿的兩個子離子的質量奇偶不同，這是甜菜堿在電噴霧串聯質譜中典型特征。說明一個子離子含有氮原子，另一個子離子則不含氮原子，并且含氮原子的子離子峰比較強，也就可以推出羧基和氮原子之間碳氮鍵容易斷裂，其碎裂機理如圖3所示。

圖4為糖甜菜水提取液的電噴霧質譜圖，盡管沒有經過復雜的前處理，提取液所含成分很多，但是m/z118峰仍然比較明顯，對m/z118離子做串聯質譜，所得譜圖與圖2相同 （圖略），因此可以證明該峰就是甜菜堿的質譜峰。

3 結論

甜菜堿在水溶液中容易聚合，但是酸堿可以通過減少其電荷位點抑制其聚合。在電噴霧質譜中甜菜堿不僅能和質子加和，還能夠和鈉離子和鉀離子結合。在我們的研究中甜菜中多種化合物與甜菜堿一樣能夠和金屬離子結合，這可以解釋甜菜能夠耐鹽堿脅迫機制。在酸性條件下，甜菜堿的電噴霧質譜圖比較簡單，容易解析，為最佳檢測條件。甜菜堿的質子親核勢高，適合電噴霧質譜檢測，甜菜提取液不需復雜的前處理就可以檢測出甜菜堿，其特征的碎裂方式為該化合物的定性提供堅實的依據，用電噴霧質譜法檢測甜菜堿具有靈敏度高、特異性強，操作簡單，快速等優點，可以作為復雜體系中甜菜堿快速檢測的絕佳方法。

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