茶樹脫水素基因dhn2原核表達條件優化

房超，李葉云，常欣，丁菲，江昌俊

（安徽農業大學茶葉生物化學與生物技術教育部重點實驗室，安徽合肥230036）

茶樹脫水素基因dhn2原核表達條件優化

房超，李葉云，常欣，丁菲，江昌俊*

（安徽農業大學茶葉生物化學與生物技術教育部重點實驗室，安徽合肥230036）

為了提高可溶性脫水素dhn2重組蛋白在大腸桿菌的表達量，研究了不同誘導條件對其表達的影響，包括誘導時間，誘導溫度，IPTG濃度和初始誘導濃度。結果表明：重組表達載體pEASY-E1-dhn2在大腸桿菌中最佳誘導時間為4h，最佳誘導溫度為30℃，最佳IPTG誘導濃度為0.8mmol/L，最佳誘導初始濃度為OD600=0.2。

茶樹；脫水素；條件優化

脫水素最早發現于20世紀80年代，屬于LEAD-Ⅱ家族，分子量從9到200kD不等[1]。脫水素富含甘氨酸和賴氨酸，具有很高的親水性，能與膜脂結合阻止水分過多流失，以保護細胞免受干旱損傷[2-4]。另外，脫水素還具有蛋白保護能力，其K片段的雙親水α-螺旋結構可以穩定蛋白質結構，起到了類似于分子伴侶的作用[5]。柑橘[6]、桃樹[7]和菠菜[8]等植物中發現脫水素能在低溫下維持乳酸脫氫酶的活性。而茶樹體內的脫水素蛋白的功能研究少見報道。

1 材料和方法

1.1.2 試劑胰蛋白胨，酵母浸出粉，氯霉素，氨芐青霉素購自索萊寶公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷購自上海生工；分子質量蛋白Marker購自北京天根公司。

1.2.1 誘導時間優化

預培養菌液至OD600=0.5時，分裝5mL菌液至滅菌的試管中，加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG，37℃繼續培養。在0h，2h，3h，4h，6h，8h時分別取菌液離心收集菌體，用bindingbuffer（50mmol/LPBSBuffer pH7.9，300mmol/LNacl，10mmol/L咪唑）懸浮菌體。冰水浴超聲破碎（功率300W，破碎1s，間隙5s，每次循環數50，共5次）后，于4℃，8000r/min離心20min，保存上清。280nm下檢測上清中蛋白總量，取含等量蛋白質的上清處理，參照分子克隆實驗指南[9]方法進行SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白表達情況。

1.2.2 誘導溫度優化

預培養菌液至OD600=0.5時，取5mL菌液至滅菌的試管中，加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG后，分別轉入16℃，25℃，30℃，37℃繼續培養4h后，按1.2.1方法處理菌液，進行SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白表達情況。

1.2.3 IPTG濃度優化

預培養菌液至OD600=0.5時，取5mL菌液至滅菌的試管中，分別向各試管中加入終濃度為0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1mmol /L、2mmol/L的IPTG，37℃繼續培養4h后，按1.2.1方法處理菌液，進行SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白表達情況。

1.2.4 初始菌液濃度優化

預培養菌液至OD600分別為0.2，0.3，0.5，0.9，1.0時取5mL菌液分裝至試管中，加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG，37℃繼續培養4h后，按1.2.1方法處理菌液，進行SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白表達情況。

2 結果與分析

圖1 不同誘導時間誘導的SDS-PAGE分析1：蛋白分子量標準；2：誘導前；3：2h；4：3h；5：4h；6：6h；7：8h

圖2 不同誘導時間的生物量分析

SDS-PAGE檢測發現隨著誘導時間增加，重組蛋白的表達量不斷升高，至4h達到最大，占上清中總蛋白的40.4%，之后表達量開始減少(圖1,2)。為了使重組蛋白高效表達，選擇4h為最佳的誘導時間。

SDS-PAGE檢測結果如圖3，隨著誘導溫度升高，可溶性蛋白含量增加，30℃時上清中的目的蛋白含量最高，占總蛋白的54.3%（圖4），之后融合蛋白含量開始下降。所以選用30℃作為最佳誘導溫度。

通過SDS-PAGE檢測（圖5），菌液的IPTG濃度值在0.1～0.8mmol/L時，誘導蛋白產量逐漸增大，0.8mmol/L時產量最大，占總蛋白的28%(圖6)，之后開始下降。確定0.8mmol/L為IPTG濃度的最適值。

圖3 不同溫度誘導的SDS-PAGE分析1：蛋白分子量標準；2：誘導前；3：25℃；4：16℃；5：30℃；6：37℃

圖4 不同溫度誘導的生物量分析

圖5 不同IPTG濃度誘導的SDS-PAGE分析1：蛋白分子量標準；2：誘導前；3：0.1mmol/L；4：0.2mmol/L；5：0.5mmol/L；6：0.8mmol/L；7：1.0mmol/L；8：2.0mmol/L

圖6 不同IPTG濃度誘導的生物量分析

圖7 不同初始菌液濃度誘導的SDS-PAGE分析1：蛋白分子量標準；2：誘導前；3：OD600=0.2；4：OD600=0.3；5：OD600=0.5；6：OD600=0.9；7：OD600=1

圖8 不同初始菌液OD的生物量分析

如圖7所示，菌液OD600=0.2時，可溶蛋白含量最高，占總蛋白的25.6%，隨后菌液上清中的可溶蛋白量隨著初始誘導濃度的增加而減少，到OD600=1.0時，可溶性蛋白只占總蛋白的12.9%（圖8）。

3 討論

本文研究結果表明誘導溫度、時間、IPTG濃度和初始菌液濃度對可溶性脫水素dhn2重組蛋白的表達量影響很大，其中以誘導溫度最為明顯。可溶性脫水素融合蛋白的含量對之后的蛋白純化影響很大。大量的可溶性蛋白可減少鎳離子親和層析時的非特異性吸附，因而蛋白純化的效果顯著提高。所以本文選用可溶性蛋白的含量百分數作為選擇原核表達條件的主要參考標準。經過SDS-PAGE電泳和QuantityOne軟件分析，發現表達工程菌中的可溶性脫水素蛋白含量在4h表達量最大，隨后逐漸降低。可能是隨著時間的延長，培養基中的營養物質逐漸減少，不能滿足細菌的生長需求。誘導溫度對可溶性融合蛋白的含量影響非常大，低溫下菌體生長緩慢，表達的重組蛋白量降低。但溫度過高，蛋白質可能會因非正常折疊而形成包涵體，致使可溶性蛋白含量相應減少。低濃度的IPTG對誘導效果影響不大，高濃度的IPTG對細胞的毒性作用使細菌生長緩慢。初始菌液濃度和可溶性脫水素蛋白含量百分比成反比，所以對高濃度的菌液進行誘導表達不利于可溶性蛋白的收集。

[1]Mundy J, Chua N H. 1988. Abscisic acid and water stress induce the expression of a novel rice gene [J]. EMBO, 1988, 7: 2279～2286..

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[3]AllagulovaCR,GimalovFR,ShakirovaFM&VakhitovVA.Theplant dehydrins:Structureandputativefunctions.Biochemistry(Moscow),2003,68 (9):945～951.

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[5]DavidsonWS,JonasA,ClaytonDF,GeorgeJM.Stabilizationofalpha-synucleinsecondarystructureuponbindingtosyntheticmembranes [J].BiolChem,1998,273:9443～9449.

[6WisniewskiME;WebbR;BalsamoR.Purification,immunolocalization, Cryoprotective,andantifreezeactivityofPCA60:Adehydrinfrompeach (Prunuspersica)[J].PhysiologiaPlantarum,1999,105(4):600～608.

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[9]JosephSambrook,DavidWRussell,JoeSambrook.MolecularCloning [M].ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001.

Q344+.13

A

1006-5768(2011)04-0153-03

2011-05-23

房超(1985-)，男，碩士，研究方向為茶樹生物技術及種質資源。

江昌俊（1957-），男，教授，E-mail:jiangcj@ahau.edu.cn

國家自然科學基金項目(No.30871568)和安徽省自然科學基金項目（NO.090411014）。