多途徑干預HH cy致兔動脈粥樣硬化的對比研究

康愛英 王國慶

南陽醫學高等專科學校 南陽 473058

近年研究發現,高同型半胱氨酸血癥(HHcy)是誘發動脈粥樣硬化(AS)的獨立危險因素[1],因此,開展HHcy致AS的防治研究是心、腦血管病領域的熱點問題。目前,對HHcy的防治多集中在補充葉酸和維生素B6、B12方面,而牛磺酸(Taurine,Tau)和中藥丹參(Salvia M iltiorrhiza)對HH-cy的影響國內外少有報道。本文采用高蛋氨酸飲食的方法建立HHcy兔動物模型,觀察HHcy致AS形成機制;比較分析牛磺酸、維生素及丹參對HHcy所致AS的干預效果,為HHcy的防治,延緩或阻止AS的形成,降低心、腦血管病的發生風險開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 藥品、儀器 L-蛋氨酸購自張家港市華昌藥業有限公司,牛磺酸上海伯奧生物科技公司提供。同型半胱氨酸(H cy)、丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、一氧化氮(NO)、內皮素(ET)、血栓素B2(TXB2)試劑盒購自北京九強生物技術和南京建成有限公司。美國GELg-9彩色多普勒超聲診斷儀,TBA-120FR生化分析儀,日本JVCTK-C921EC顯微鏡攝像機、OLYM PUSCX31顯微鏡,德國m ICROMGMBH Hm 200切片機、CSˉ攤片機。

1.2 動物分組 篩選健康雄性家兔50只(武漢嘉禾實驗動物公司提供),月齡3～5個月,體質量1.5～2.0 kg,標準飼料適應性喂養2周,隨機分為對照組(NC)、蛋氨酸組(Met)、牛磺酸組(Tau)、維生素組(V it)、丹參組(SM)5組,每組10只。

1.3 H hcy動物模型的建立 (1)蛋氨酸飼料的制備:標準飼料按家兔標飼配方制成,在標飼中添加2%的蛋氨酸即為蛋氨酸飼料。(2)丹參口服液由南陽醫專中醫藥教研室用丹參經煎制、過濾、濃縮為1g/m L(以生藥計),經高壓滅菌備用。(3)動物飼養:NC組喂標準飼料;Met組喂蛋氨酸飼料;Tau組蛋氨酸飼料+牛磺酸0.3g/(kg?d)只灌胃;Vit組蛋氨酸飼料+葉酸1.5 mg/(kg?d)、VB120.25 mg/(kg?d)、VB620 mg/(kg?d)灌胃;SM組蛋氨酸飼料+丹參口服液3.3 g/(kg?d)灌服。動物飼料按100g/(d?只)計算,分籠飼養,隔周稱重,連續喂養8周。(4)Hhcy模型判定:0周時測定各組兔血漿H cy含量,確定正常參考值;4周時再次檢測,以血漿Hcy水平超過正常參考值上限,判定HHcy病理模型是否成功。

1.4 生化指標檢測 分別于第0周、4周、8周末時,自兔耳緣靜脈采血2 m L,用酶法或比色等法測定Hcy、TC、TG、NO、M DA、SOD、ET、TXB2含量,試劑盒由北京九強和南京建成公司提供。

1.5 血管超聲檢查 用彩色多普勒超聲診斷儀,血管探頭頻率為4～10 MHz,分別于第4周、8周末對各組家兔進行腹主動脈血管超聲檢查,測量動脈內-中膜厚度(IM T)及血流峰值(Vp)。同時觀察血管內膜光滑程度、有無粥樣斑塊形成。

1.6 病理學檢查 實驗8周末,處死動物,取腹主動脈血管,10%福爾馬林固定、取材、石蠟切片、H-E染色,光鏡觀察。

2 結果

2.1 各組家兔血漿H cy含量變化 0周時各組家兔血漿H cy含量16.67～22.44μmol/L(即正常參考值),超過上限確定為HHcy。實驗期間各組家兔一般情況良好,Met組有2只、Tau組1只死亡。各組兔血漿H cy含量變化見表1。

表1 各組家兔血漿H cy含量比較 (±s,μmol/L)

表1 各組家兔血漿H cy含量比較 (±s,μmol/L)

注:與NC組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與Met組比較,★P＜0.01;與Tau組比較,◆P＜0.05,◆◆P＜0.01

組別0周(只)4周(只)8周(只)NC組18.15±1.71(10)18.12±1.33(10)19.09±1.20(10)Met組19.34±1.65(10)62.92±2.26(9)**65.23±1.12(8)**Tau組18.47±1.02(10)57.03±2.19(10)**58.27±2.25(9)**SM組18.13±2.01(10)53.44±2.33(10)**56.37±1.29(10)**Vit組19.23±2.47(10)32.53±1.28(10)*★◆22.35±2.30(10)★◆◆

2.2 各組家兔血清TC、TG、MDA、SOD含量變化 各組血清TC、TG、MDA、SOD含量變化見表2。

表2 各組家兔血清TG、TC、MDA、SOD含量比較 (ˉ±s)

表2 各組家兔血清TG、TC、MDA、SOD含量比較 (ˉ±s)

注:與NC組同期比較,＊P＜0.05,＊＊P＜0.01;與Met組同期比較,﹟P＜0.05,﹟﹟P＜0.01

組 別時間n TG(mmol/L)TC(mmol/L)M DA(μmol/L)SOD(U/m L)NC組4周10 1.05±0.13 1.56±0.11 21.83±7.32 368.32±25.14 8周10 1.06±0.09 1.57±0.12 22.32±6.02 370.28±23.46 Met組4周9 1.21±0.03*1.74±0.08*40.06±9.03**311.58±24.38**8周8 1.41±0.09*1.93±0.14*45.27±8.16**285.35±26.30**Tau組4周10 1.13±0.10 1.56±0.16#28.27±5.11*#406.69±22.06##8周9 1.12±0.11 1.61±0.15﹟24.36±6.72##423.28±24.21##SM組4周10 1.07±0.11#1.52±0.16#26.20±0.18#439.62±27.63##8周10 1.02±0.07#1.66±0.13#23.12±0.17##473.69±28.09##V it組4周10 1.08±0.12#1.59±0.10 25.24±5.58#416.16±18.97##8周10 1.09±0.12#1.65±0.18#22.48±7.44##420.48±21.56##

2.3 各組家兔血清NO、ET、TXB2含量變化 實驗8周時,各組血清NO、ET、TXB2含量變化見表3。

表3 實驗8周各組家兔NO、ET、TXB2含量比較 (±s)

表3 實驗8周各組家兔NO、ET、TXB2含量比較 (±s)

注:與NC組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與Met組比較,#P＜0.05,##P＜0.01

組 別n NO(μmo l/L)ET(ng/L)TXB2(ng/L)NC組10 99.33±19.41 172.25±30.32 134.50±29.17 Met組8 57.96±13.80*309.91±31.83**345.33±35.27**Tau組9 150.29±20.26**##180.65±28.52##162.37±32.90##SM組10 132.12±14.22*##192.28±17.36##154.48±21.43##V it組10 159.37±30.26**##178.92±26.90##145.68±24.36##

2.4 各組家兔腹主動脈超聲檢查結果比較 實驗4周時,NC組血管內膜線細、光滑、連續性好;M et組血管內膜欠光滑,邊緣不整齊,有中等偏低回聲團塊(即軟斑形成);Tau、SM和V it干預組無明顯改變。8周末,M et組血管IM T明顯增厚(P＜0.01),有偏強回聲團,斑塊邊界不清,Vp顯著增快(P＜0.01)。Tau、SM和Vit干預組與Met比較IM T顯著減小,Vp顯著減慢(P＜0.05),均未見斑塊形成,3組間比較差異無顯著性。

2.5 各組家兔腹主動脈血管病理變化 大體觀察:沿腹主動脈管壁剪開,NC組無斑塊形成,M et組可見不規則隆起斑塊。光鏡下觀察:NC組血管內膜薄而光滑,連續性好,中膜平滑肌細胞排列整齊,管壁厚薄均勻。M et組:血管內膜明顯增厚,斑塊突出于內膜面,內膜下大量排列不規則的平滑肌細胞,中層結構紊亂,斑塊深部的泡沫細胞有變性壞死、崩解,形成細顆粒狀粥糜樣物質,中膜變淺,淺層肌纖維分離斷裂。Taut、SM和Vit干預組血管內膜光滑,8周時內膜有輕度增厚,內膜下有少量含脂質的泡沫細胞,中膜平滑肌細胞排列整齊,管壁厚薄均勻。

3 討論

AS、腦卒中、冠心病是現代醫學中最大的醫學難題,由此而引起的致死率在中國乃至全世界都直線上升。近年的研究證實HH cy是AS新的、獨立的危險因子,引起HHcy的原因有營養因素或遺傳因素。

3.1 HHcy家兔病理模型制備成功 本研究給家兔喂飼高蛋氨酸飼料,實驗第0周、4周、8周時測定血清Hcy水平,Met組血清H cy含量均顯著高于同期NC組,表明兔HHcy模型制備成功。腹主動脈超聲及組織學檢查顯示,血管內膜明顯增厚,中層結構紊亂,有細顆粒狀粥糜樣物質及斑塊形成,均為動脈硬化改變,故認為,HHcy可引起動脈血管發生病理改變,是致AS的獨立危險因素。

3.2 HHcy致動脈粥樣硬化的機制 HHcy致動脈粥樣硬化的機制目前尚未完全闡明,可能與血管內皮損傷和功能失調、刺激血管平滑肌增值、促進血小板聚集、破壞體內凝血與纖溶之間的平衡等因素有關[2]。血管內皮細胞作為血管壁與血流之間的屏障,其損傷和功能的減退是動脈粥樣硬化的重要始動因素。H cy升高可通過氧化應激及活性氧基團導致內皮功能紊亂,引起血管內皮損傷。實驗中發現,Met組家兔血清MDA、TG、TC、ET和TXB2含量顯著高于NC組,而NO含量、SOD活力則明顯降低。結果提示,HHcy家兔體內氧化應激增強,Hcy是多功能損傷因子[3],其分子中含自由的巰基,在自身氧化生成同型胱氨酸的同時,生成多種強氧化產物(如H2 O2、氧自由基等),造成血管內皮細胞損傷和強烈的毒性作用,并啟動細胞膜脂質過氧化反應,使MDA產生增多,消耗了SOD等自由基清除系統;而且H cy的升高可抑制SOD的表達和分泌,導致內皮細胞抗氧化機制受損[4],并加強了超氧自由基介導的NO滅活作用,引起內皮細胞功能失調,破壞細胞的完整性,使血管內皮細胞骨架結構發生變化;Hcy還能促進脂蛋白的沉積,并被巨噬細胞吞噬形成泡沫細胞,損傷血管內皮細胞,引起動脈粥樣硬化斑塊形成。

本實驗M et組家兔血清ET、TXB2顯著增多,NO含量明顯減少,與文獻報道相符。家兔腹主動脈內膜發生明顯病理改變,充分表明HH cy家兔體內正常的血管內環境穩定被破壞,是因為Hcy升高損傷了血管內皮,促進血管平滑肌細胞增殖、遷移,使多種血管活性物質的生成和分泌失衡[5],即收縮血管,促進血小板聚集和血栓形成,刺激平滑肌細胞增殖的ET、TXB2增多,而血管松弛因子NO含量減少,從而導致內皮依賴性血管舒張功能失調,促進AS的發生和發展。

3.3 FA、B6、B12有效地降低血漿H cy水平 FA在體內還原為四氫葉酸,參與甲基的轉移;維生素B12為蛋氨酸合成酶的輔酶,催化N5-甲基四氫葉酸脫去甲基再生成四氫葉酸,而Hcy獲得甲基生成蛋氨酸。維生素B6是胱硫醚合成酶的輔酶,催化Hcy與絲氨酸結合成胱硫醚,進一步分解代謝。本實驗V it干預組血清Hcy、MDA、ET、TXB2含量顯著低于Met組,NO含量、SOD活力明顯升高;血管超聲及組織學觀察,內膜較光滑,內膜及中膜平滑肌細胞未見增生,與NC組比較無顯著差異。提示FA、VB6、VB12是同型半胱氨酸代謝主要的輔助因子,加速了H cy再甲基化或硫化進程,有效降低H cy水平,從而減輕血管內皮的損傷、血管平滑肌的增值,阻止或延緩了AS發生。

3.4 牛磺酸的抗動脈硬化作用 牛磺酸是一種含磺酸基的自由氨基酸,不參與蛋白質的合成,長期被看作是含硫氨基酸代謝的無功能產物。近年研究發現[6],牛磺酸具有維持滲透壓、穩定細胞膜、調節細胞鈣穩定、清除自由基、抑制脂質過氧化等生物學效應。HHcy還可導致大鼠血管內皮細胞結構受損,彈力纖維層排列紊亂、血漿ET含量增加,外源性增補牛磺酸完全抑制了H cy誘導的上述血管病變。

本研究Tau組家兔血清MDA、ET、TXB2含量顯著低于M et組,NO含量、SOD活力明顯升高,而H cy含量顯著高于NC組但與Met組比較無顯著差異;血管超聲及組織學觀察,血管內膜光滑,IM T比Met組顯著變薄,Vp顯著減慢,與NC組比較無顯著差異。結果顯示,牛磺酸不僅抑制Hcy誘導的呼吸鏈電子漏出及氧自由基生成[7]和脂質過氧化,降低MDA含量,增加SOD活力,拮抗Hcy引起的氧化應激損傷;還可上調NO含量,降低ET、TXB2水平,從而起到舒張血管,保護內皮細胞作用。牛磺酸作為H cy的生物拮抗劑,可不通過降低血漿H cy水平而直接拮抗H cy引起的血管病變和氧化應激損傷,從而發揮抗AS形成的作用。

3.5 丹參對HH cy家兔動脈粥樣硬化形成的干預作用 本研究中SM組血漿Hcy含量高于NC組,但與M et組同期比較TG、TC、MDA、ET、TXB2含量顯著降低,NO、SOD活顯著升高;血管超聲及組織學觀察無斑塊形成,故認為丹參不但有抗高脂血癥引起的AS,而對HH cy所致家兔動脈粥樣硬化的形成也有干預作用。其機制可能是丹參的有效成分丹參酮具有天然抗氧化作用[8],通過消除脂類自由基而阻斷脂質過氧化的鏈式反應;降低縮血管成分ET、TXB2水平,提升血管松弛因子NO含量,起到舒張血管,保護內皮細胞;調節HHcy家兔體內凝血與纖溶之間的平衡等因素,從而發揮其延緩或阻止HHcy兔動脈粥樣硬化形成的作用。

綜上所述,高蛋氨酸飲食可誘發家兔HHcy,Hcy升高可通過損傷血管內皮、促進血管平滑肌增殖等機制,導致AS的發生。外源性補充FA、B6、B12加速Hcy代謝,降低血漿Hcy水平,減輕血管內皮的損傷;牛磺酸和丹參雖不能降低血漿H cy含量,但通過抑制Hcy誘導的氧化應激和細胞增值,調節血管舒縮及凝血與纖溶之間的平衡等因素,發揮其抗AS形成的作用。可見丹參、牛磺酸、維生素通過不同途徑干預HH cy家兔AS形成,其干預效果維生素和丹參優于牛磺酸。

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