GKN、TFF蛋白與胃癌*

王鈺虹 綜述 陳 潔 陳旻湖 審校中山大學附屬第一醫院消化內科（510080）

胃癌是嚴重危害人類健康和生命的疾病，為亞洲地區最常見的惡性腫瘤之一，病死率位居全球惡性腫瘤的第二位[1]。胃癌的發生和轉移是環境、宿主等多因素、多步驟相互作用的結果，目前對胃癌發生和轉移分子機制的研究取得了巨大進展，但多數分子改變均非胃癌特異性。Gastrokine（GKN）和三葉因子家族（TFF）蛋白（除外 TFF3）在正常胃黏膜組織中大量表達，而在胃癌組織中表達顯著下降甚至缺失，提示兩者可能是胃癌的特異性抑癌基因。本文就GKN和TFF蛋白與胃癌的關系作一簡要綜述。

一、GKN家族蛋白

目前發現GKN家族蛋白包括三個成員，即GKN1、GKN2 和 GKN3。 GKN1，既往稱為 CA11、AMP-18、foveolin 或TFIZ2，現統一命名為GKN1[2]。該基因位于染色體2p13.3，全長約6 kb，含有6個外顯子和5個內含子，翻譯出的肽鏈由185個氨基酸組成，其中第54～150位氨基酸形成一個保守的結構域BRICHOS。GKN1基因序列在不同物種之間（包括人、小鼠、大鼠、豬、牛等）的一致性很高，說明其在進化上的高度保守性[2]。GKN1是胃黏液層的組成成分之一，具有促進胃黏膜上皮細胞分裂和移行、維持胃黏膜完整和促進受損黏膜修復的功能[3]。GKN1 mRNA和蛋白在正常胃小凹上皮細胞中均高表達[2]，其表達受多種胃黏膜損傷因素的影響，幽門螺桿菌（H.pylori）感染和非甾體消炎藥（NSAIDs）如阿司匹林的使用可導致GKN1表達下降，從而造成胃黏膜損傷[4,5]。

GKN2，又稱為 TFIZ1、GDDR或 blottin，是 GKN家族的第二個成員。GKN2基因亦定位于染色體2p13.3，與GKN1相距22 kb。杜建軍等[6]的研究發現人GKN2與來自鼠正常胃的一大小為750 bp的基因部分同源，提示該基因的進化比較保守；GKN2由5個外顯子構成，編碼184個氨基酸，其中第54～155位氨基酸亦含有BRICHOS蛋白功能域。進一步研究[7]發現，GKN2亦特異性表達于胃黏膜上皮細胞，具有類似GKN1維持黏膜完整和調節上皮細胞增殖的作用；其表達受不同細胞因子如腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β、IL-6 等的調節[8]。

GKN3基因在鼠科動物中定位于染色體6qD1，含有6個外顯子，編碼一種由181個氨基酸殘基組成、大小約19 kDa（1 Da=0.9921 u）的分泌蛋白質。該蛋白亦包含BRICHOS蛋白功能域，含有通過二硫鍵連接的位于4個保守位點上的半胱氨酸殘基和N末端信號肽。GKN3蛋白僅在胃頸黏液細胞中表達，且胃竇部含量顯著高于胃底。通過校準鼠GKN3基因序列發現人GKN3基因定位于染色體2p14，與GKN2保守連鎖。但采用表達的序列標記（EST）等方法并不能從人類胃活檢組織中檢測到GKN3蛋白，提示該蛋白在人類中的表達缺乏活性。進一步研究發現人類存在GKN3基因的提前終止密碼子W59X，可能導致GKN3功能缺失。種群遺傳分析顯示遺傳GKN3通讀等位基因（read-through allele）主要存在于非洲人群中，而W59X在非非洲人群中的檢出率較高，其導致GKN3失活可能是近代進化過程中地區選擇性壓力的結果[9]。

GKN家族成員均含有BRICHOS結構域。該結構域是由Sánchez-Pulido等[10]報道的人類又一保守的蛋白功能域家族，約由100個氨基酸組成，其保守序列主要位于一對可形成二硫鍵而發揮蛋白折疊作用的半胱氨酸周圍。目前推測BRICHOS結構域具有以下重要功能：①介導特異性細胞內蛋白酶解過程；②作為分子內分子伴侶，穩定蛋白的分子構象；③BRICHOS結構域改變會導致包括腫瘤在內的多種疾病的發生。

二、TFF蛋白

TFF蛋白主要由胃腸道黏液分泌細胞產生并分泌至管腔中發揮作用，主要包括三個蛋白成員，分別為TFF1、TFF2和TFF3[11]。

TFF三個家族成員基因均位于染色體21q22.3，擁有獨特保守的“三葉草”結構。該結構通過6個半胱氨酸殘基以1-5、2-4、3-6交聯的方式形成二硫鍵，通過二硫鍵連接形成3個環狀結構，使TFF能抵抗蛋白酶的消化，從而在胃腸腔內發揮黏膜保護功能[11]。TFF蛋白是胃腸道黏膜損傷時上調的急性反應蛋白，具有很強的促細胞運動作用，能維持黏膜表面屏障功能和促進黏膜損傷后的修復[12]。

三、GKN和TFF蛋白在胃癌中的表達及其作用

1.GKN：2001年Kim等[13]的研究發現，胃腺瘤和胃癌中染色體2p雜合性丟失（LOH）的發生率分別為50%和70%，表明染色體2p上可能存在與胃腺瘤、胃癌密切相關的基因，參與胃腺瘤向胃癌的轉變過程，與胃癌的發生、發展密切相關。有研究發現，GKN1蛋白大量特異性地表達于正常胃黏膜上皮，在慢性萎縮性胃炎、胃腸上皮化生、胃上皮細胞異型增生、胃腺瘤等一系列癌前病變中的含量逐漸下降，胃癌組織中的表達完全缺失，而在癌旁正常胃黏膜組織中仍可檢測到[2]。杜建軍等[14]將GKN1轉染胃癌細胞株SGC7901后發現，細胞生長受到明顯抑制；Rippa等[15]發現胃癌細胞株 AGS和MKN28轉染GKN1并以Fas單克隆抗體治療后，Fas受體凋亡明顯增加；且其誘導的凋亡能被caspase-3和caspase-8抑制劑所抑制[16]；由此可見，GKN1可能是新的胃癌特異性抑癌基因[14]。有研究[7]發現GKN2具有抑制胃癌細胞增殖的作用。而對于GKN3，提前終止密碼子W59X引起mRNA無義突變降解，使GKN3在近代人群，尤其是非非洲人種中難以檢測到并分析其功能，因此目前對GKN3在胃癌中的表達和作用仍不甚了解[9]。

2.TFF蛋白：胃癌組織中可發現TFF1基因存在LOH[17]；在胃癌小鼠模型中，TFF1基因啟動子區甲基化水平明顯升高，導致表達明顯下調[18]；Bossenmeyer-Pourié等[19]發現，TFF1通過延遲腫瘤細胞從G1期向S期轉化，從而抑制細胞增殖；TFF1還可通過抑制caspase-9活性，抑制各種因素導致的胃上皮細胞凋亡，這種看似矛盾的抗增殖和抗凋亡雙重作用使TFF1在胃癌發生、發展中起有重要調節作用。TFF2在胃癌中的表達亦明顯下降甚至缺失[20]；Peterson等[21]發現在H.pylori感染的野生型小鼠模型中，TFF2基因啟動子區甲基化導致其沉默。TFF3在胃癌發生過程中的作用可能不同于TFF1和TFF2，其在胃癌多階段發生過程中的表達逐漸增高[20]；Kaise等[22]發現聯合檢測血清TFF3和前列腺素可能有助于早期發現胃癌，尤其是腸型胃癌。

四、GKN與TFF的相互作用

鑒于GKN與TFF蛋白在組織細胞定位、生理功能和胃癌發生過程中變化趨勢的相似性，推測這兩個家族蛋白之間可能存在緊密聯系。

有研究發現，人正常胃黏膜上皮中可分離出一種分子質量約 25 kDa的復合物，由 GKN2（18.31 kDa）與 TFF1（6.67 kDa）通過二硫鍵以1∶1的比例結合而成。該二硫鍵由GKN2的BRICHOS結構域內第38位半胱氨酸殘基（Cys38）與TFF1的第58位半胱氨酸殘基（Cys58）構成，由此將兩個蛋白單體連接形成一個異源二聚體復合物。該復合物是TFF1在正常胃黏膜上皮發揮作用的主要形式，而胃癌細胞中TFF1與GKN2發生解離可能使TFF1失去正常的功能，從而促進腫瘤的發生、發展[23]。此外，Otto等[24]在小鼠體外實驗中發現GKN2能與TFF2蛋白結合，可能是不同物種GKN對結合TFF蛋白具有不同選擇偏好所致。

亦有研究發現，GKN3與TFF2共同表達于小鼠胃黏膜上皮和十二指腸Brunner’s腺，其中GKN3位于頸黏液細胞的較低部位，TFF2位于較高部位；在TFF2缺失的小鼠中，萎縮的胃黏膜可明顯誘導GKN3表達，從而顯著抑制胃上皮細胞增殖[9]。

除外GKN2可分別與TFF1和TFF2相互結合的報道外，目前尚無兩個家族蛋白中其他成員間相互關系的研究。但推測由BRICHOS結構域與三葉草結構中的半胱氨酸殘基連接形成的二硫鍵很可能是維系GKN與TFF蛋白之間關系的紐帶，為今后繼續深入研究這兩個家族蛋白之間的結構和功能關系提供方向。

五、展望

由此可見，除TFF3外，其他GKN和TFF蛋白在胃癌組織和細胞株中的表達明顯下調甚至缺失，并可抑制胃癌細胞增殖，提示這兩個家族蛋白可能是胃癌特異性抑癌基因。但目前仍有許多問題尚待解決，如GKN和TFF兩個家族蛋白是否還有其他成員？除TFF1和TFF2分別與GKN2相互結合外，是否還有其他成員之間的相互作用？GKN與TFF蛋白能否作為胃癌診斷和治療的特異性分子靶點？對以上問題進行深入研究，將有助于進一步揭示胃癌的分子發病機制，并可能為胃癌的治療提供新靶點。

1 Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002.CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

2 Oien KA,McGregor F,Butler S,et al.Gastrokine 1 is abundantlyand specifically expressed in superficial gastric epithelium,down-regulated in gastric carcinoma,and shows high evolutionary conservation.J Pathol,2004,203(3):789-797.

3 Toback FG,Walsh-Reitz MM,Musch MW,et al.Peptide fragments of AMP-18,a novel secreted gastric antrum mucosal protein,are mitogenic and motogenic.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2003,285 (2):G344-G353.

4 Nardone G,Rippa E,Martin G,et al.Gastrokine 1 expression in patients with and without Helicobacter pylori infection.Dig Liver Dis,2007,39(2):122-129.

5 Martin G,Wex T,Treiber G,et al.Low-dose aspirin reduces the gene expression of gastrokine-1 in the antral mucosa of healthy subjects.Aliment Pharmacol Ther,2008,28(6):782-788.

6 杜建軍,竇科峰,彭淑牖,等.胃癌下調全長基因GDDR的克隆及與胃癌關系的研究.中華醫學雜志,2003,83(13):1166-1168.

7 杜建軍,竇科峰,彭淑牖,等.胃癌相關新基因GDDR的研究.中華外科雜志,2005,43(1):10-13.

8 Baus-Loncar M,Lubka M,Pusch CM,et al.Cytokine regulation of the trefoil factor family binding protein GKN2 (GDDR/TFIZ1/blottin)in human gastrointestinal epithelial cells.Cell Physiol Biochem,2007,20(1-4):193-204.

9 Menheniott TR,Peterson AJ,O’Connor L,et al.A novel gastrokine,Gkn3,marks gastric atrophy and shows evidence of adaptive gene loss in humans.Gastroenterology,2010,138(5):1823-1835.

10 Sánchez-Pulido L,Devos D,Valencia A.BRICHOS:a conserved domain in proteins associated with dementia,respiratory distress and cancer.Trends Biochem Sci,2002,27(7):329-332.

11 Sands BE,Podolsky DK.The trefoil peptide family.Annu Rev Physiol,1996,58:253-273.

12 DossingerV,KayademirT,Blin N,etal.Downregulation of TFF expression in gastrointestinal cell lines by cytokines and nuclear factors.Cell Physiol Biochem,2002,12(4):197-206.

13 Kim HS,Woo DK,Bae SI,et al.Allelotype of the adenoma-carcinoma sequence of the stomach.Cancer Detect Prev,2001,25(3):237-244.

14 杜建軍,竇科峰,曹云新,等.胃癌下調新基因CA11的功能研究.世界華人消化雜志,2002,10(5):525-529.

15 Rippa E,La Monica G,Allocca R,et al.Overexpression of gastrokine 1 in gastric cancer cells induces fas-mediated apoptosis.J Cell Physiol,2010(Epub ahead of print).

16 Yoon JH,Song JH,Zhang C,et al.Inactivation of the Gastrokine 1 gene in gastric adenomas and carcinomas.J Pathol,2011,223(5):618-625.

17 Park WS,Oh RR,Park JY,et al.Somatic mutations of the trefoilfactorfamily1 genein gastriccancer.Gastroenterology,2000,119(3):691-698.

18 Tomita H,Takaishi S,Menheniott TR,et al.Inhibition of gastric carcinogenesis by the hormone gastrin is mediated by suppression of TFF1 epigenetic silencing.Gastroenterology,2011,140(3):879-891.

19 Bossenmeyer-Pourié C,Kannan R,Ribieras S,et al.The trefoilfactor1 participates in gastrointestinalcell differentiation by delaying G1-S phase transition and reducing apoptosis.J Cell Biol,2002,157(5):761-770.

20 Leung WK,Yu J,Chan FK,et al.Expression of trefoil peptides(TFF1,TFF2,and TFF3)in gastric carcinomas,intestinal metaplasia,and non-neoplastic gastric tissues.J Pathol,2002,197(5):582-588.

21 Peterson AJ,MenheniottTR,O’ConnorL,etal.Helicobacter pylori infection promotes methylation and silencing of trefoil factor 2,leading to gastric tumor development in mice and humans.Gastroenterology,2010,139(6):2005-2017.

22 Kaise M,Miwa J,Tashiro J,et al.The combination of serum trefoil factor 3 and pepsinogen testing is a valid non-endoscopic biomarker for predicting the presence of gastric cancer:a new marker for gastric cancer risk.J Gastroenterol,2011(Epub ahead of print).

23 Westley BR,Griffin SM,May FE.Interaction between TFF1,a gastric tumor suppressor trefoil protein,and TFIZ1,a brichos domain-containing protein with homology to SP-C.Biochemistry,2005,44(22):7967-7975.

24 Otto WR,Patel K,McKinnell I,et al.Identification of blottin:a novel gastric trefoil factor family-2 binding protein.Proteomics,2006,6(15):4235-4245.