5-脂氧合酶與動脈粥樣硬化關系研究進展

劉春麗綜述 蔡 輝審校

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是心腦血管疾病的重要病理生理基礎,近年來,大量人體和動物實驗研究表明,5-脂氧合酶(5-Lipoxygenase,5-LO)在 AS形成中發揮重要作用。本文就5-LO與AS形成的有關內容作一綜述。

1 5-LO的生物學特性

1.1 5-LO途徑

5-LO是三種脂氧合酶(5-LO、12-LO、15-LO)同工酶的一種,分子量約為72 000～80 000D,是機體催化花生四烯酸(Arachidonic Acid,AA)生成生物活性分子—白三烯(Leukotrienes,LTs)的關鍵酶。人5-LO基因位于10號染色體上,長度為82kb,主要包括14個外顯子(Exons),13個內含子(Introns)。5-LO蛋白主要由調節區和催化區兩個區域組成,二者均具有典型C2結構域,其中含有的β折疊結構主要與鈣離子、核苷酸、磷脂類結合[1],酶的催化活性主要受調節區控制。

在動物體內,5-LO催化 AA,產生5-羥-6,8,11,14-二十四碳四烯酸,生成環氧化物白三烯 A4(LTA4),LTA4在LTA4水解酶和 LTC4合成酶作用下分別生成 LTC4、LTD4,LTD4在脫肽酶作用下進一步轉化成LTE4,后三者結構中均含有半胱氨酸,故又合稱為半胱氨酸白三烯(Cysteinyl-Leukotrienes,CysLTs),這條合成LTs的途徑稱之為5-LO途徑(5-Lipoxygenase Pathway)。研究發現,5-LO途徑生成的LTs與細胞膜特殊G蛋白耦聯LTs受體結合,其中LTB4主要與 LTB受體(包括LTBR1和LTBR2),Cys-LTs主要與 CysLT受體(包括CysLTR1和 CysLTR2)通過促進炎性細胞黏附、脫顆粒(Degranulation)反應,增加血管通透性(Vascular Permeability)等作用,參與血管炎癥、動脈內膜損傷過程。此外,近年研究發現,5-LO途徑還具有轉導、調節細胞核內信號的作用。Orasanu等[2]發現5-LO途徑產物LTB4與細胞核受體結合后,激活過氧化物酶體增生物激活受體-α(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor,PPAR-α),并誘導 PPA R-α敏感基因轉錄,加劇內皮細胞炎癥反應。

5-LO作為白三烯合成限速酶,主要定位于血清和/或細胞核中,免疫組化分析顯示5-LO主要表達于小鼠動脈粥樣硬化斑塊的巨噬細胞、平滑肌細胞中。動脈內皮細胞雖不表達5-LO,但跨膜細胞代謝產生的LTA 4與內皮細胞表達的LTA 4水解酶、LTC4合成酶結合后,生成 LTB4和CysLTs,進而對內皮細胞產生作用。

1.2 5-LO活性調節因素

5-LO活性水平受多種因素調節。研究發現,細胞內鈣蛋白水平是5-LO激活的決定因素。研究發現,巨噬細胞和白細胞遷移至炎癥位點后,鈣離子釋放活化鈣通道(Calcium-Activated Release Channel,CA RC)開放后,細胞內鈣離子水平升高,鈣離子通過與5-LO的N末端C2樣結構域結合后,增加5-LO疏水性,促其轉移至細胞膜,進而與膜上5-LO激活蛋白(5-Lipoxygenase Activating Protein,FLAP)結合而發揮作用。當細胞內鈣離子濃度在4～10μmol/L時,5-LO達到最高活性水平。體內激酶水平對細胞5-LO活性也起重要調節作用。研究發現,絲裂原活化蛋白激酶激活的蛋白激酶2(Mitogen-Activated Protein Kinase-Activated Protein 2,MAPKAP-K2)和細胞外信號調節激酶(Extracellular Signal-Regulated Kinase,ERK)通過磷酸化5-LO后,均可導致其活性水平升高[3]及與細胞膜結合作用增強。當給予MAPKAP-K2和ERK抑制劑后,5-LO活性和膜結合能力均受到抑制。5-LO核心啟動子去甲基化(Demethylation)是5-LO完全表達的先決條件,當用一種去甲基化抗原處理培養中的巨噬細胞,即能明顯上調這些細胞5-LO m RNA表達水平。此外,Fair等[4]研究發現,利用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)處理U937和HL60髓細胞后,能夠顯著增加5-LO轉錄活性和FLAP的表達。

2 5-LO與AS

大量人體和動物實驗研究表明,5-LO在正常血管內膜中表達很少或幾乎不表達,而在AS損傷動脈中大量存在,主要集中于巨噬細胞、樹突狀細胞、泡沫細胞、肥大細胞、中性粒細胞等,且與AS內膜損傷程度呈正比。Mehrabian等[5]研究發現,5-LO大量表達于載脂蛋白E和低密度脂蛋白受體基因敲除(ApoE-/-/LDLR-/-)小鼠AS斑塊中,當將 5-LO+/-小鼠骨髓移入LDLR-/-高膽固醇血癥小鼠體內后,子代LDLR-/-/5-LO-/-小鼠體內AS動脈損傷明顯減少,5-LO mRNA表達水平較對照組小鼠降低5倍。此外,5-LO途徑下游產物LTB4能夠減少脂肪細胞對游離脂肪酸的攝取,造成血清游離脂肪酸水平升高;而5-LO抑制劑能夠降低脂肪組織脂解(Lipolysis)和改善體內脂質代謝。在對ApoE-/-高脂血癥小鼠肝細胞的變性研究時發現,在5-LO基因敲除小鼠體內,PPAR-γ、胰島素受體底物-1(Insulin Receptor Substrate-1)以及脂聯素(Adiponectin)表達水平均上調,導致機體脂肪組織對胰島素敏感性顯著增強[6]。亦即5-LO的作用從多個方面影響AS形成。

2.1 5-LO基因多態性與心血管病變

人的5-LO基因起始密碼子ATG上游145～179bp有一富含GC區,可以與轉錄因子Sp1結合,核心啟動子GC區包含5個 Sp1/Egr1結合序列串。Geiger等[7]通過對187名健康無親緣關系的高加索人群5-LO基因結構分析后發現,Sp1/Egr1啟動子串聯重復序列突變率最高的等位基因頻率為84%。啟動子GC框變異能夠顯著增加血管內-中膜厚度,提高血清C-反應蛋白水平,并與LTs水平一致,表明該變異可能通過上調5-LO蛋白表達而發揮作用[8]。Dwyer等[9]對470名來自洛杉磯AS協會成員5-LO啟動子基因研究后發現,6%成員發生變異,與正常野生基因組相比,攜帶兩種變異等位基因者頸動脈內-中膜厚度增加80±19μm,但給予n-3游離脂肪酸飲食以競爭性抑制5-LO底物后,能夠減少AS發生,表明5-LO啟動子基因變異與AS形成有關。Allayee等[10]也發現5-LO啟動子等位基因變異導致5-LO表達增加,增加AS和心肌梗死發生風險。但Maznyczka等[11]通過對北美高加索人群5-LO基因進行研究后發現,5-LO基因多態性并不是該人群心肌梗死的主要危險因素。

2.2 5-LO與炎癥

炎癥是AS形成的重要因素,大量炎性細胞聚集、激活,釋放大量細胞因子,造成內膜炎癥反應,最終損傷血管結構。

研究發現,在人 AS內膜中,炎癥激活的巨噬細胞、肥大細胞、樹突狀細胞均大量表達5-LO,在單核細胞轉化為組織巨噬細胞過程中,5-LO表達水平明顯上調,然而在非炎癥期,5-LO活性水平無明顯變化。Horrillo等[12]發現,在肥胖小鼠脂肪細胞中,5-LO在FLAP輔助作用下,激活脂肪細胞核因子-κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB),促進單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte Chemotactic Protein-1,MCP-1)、白介素(Interleukin,IL-6)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factorα,TNF-α)釋放增加,加劇脂肪組織炎癥反應。單核細胞聚集、黏附于血管內皮細胞,最終激活、衍化成泡沫細胞是AS形成的早期事件和始動環節。MCP-1是激活單核細胞聚集、黏附過程最重要的細胞因子。在單核細胞中,5-LO能夠通過細胞表面LTB1R和LTB2R作用,快速誘導MAPKs,ERK1/2和Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal Kinase,JNK)1/2、磷脂酰肌醇-3-激酶/丙氨酸氨基轉移酶(Phosphatidylinositol-3-kinase/Alanine Aminotransferase,PI3K/Akt)磷酸化,并在MAPK-ROS(Reactive Oxygen Species)依賴機制下增加NF-κBDNA結合活性,參與炎癥過程。在ApoE-/-/5-LO-/-小鼠損傷動脈內膜中,MCP-1合成明顯減少。5-LO途徑合成的 LTB4通過 LTBR1介導,通過激活ERK 1/2或JNK/MAPK通路,增加MCP-1轉錄活性,并呈時間和劑量依賴性,但這種作用能被LTBR1受體拮抗劑-CP105、696阻斷[13]。另外,LTB4還能增加IL-6、TNF-α表達,促進血管炎癥發生[14]。研究發現,5-LO參與激活的炎癥反應參與多種疾病的發生,而且這種炎癥對激素治療無效,但給予LTB1或CysLT1受體拮抗劑后,可明顯抑制這種炎癥反應[15]。

2.3 5-LO與血管內膜增生及斑塊形成

研究發現,5-LO途徑與AS內膜增生及斑塊形成密切相關。細胞因子IL-1β能夠促進內膜增厚、平滑肌細胞增殖,5-LO能夠誘導單核細胞分泌IL-1β,當抑制5-LO或FLAP作用時,IL-1β分泌減少。AS斑塊造成的血管狹窄起始于血小板沉積,由激活的血小板釋放大量促有絲分裂物質促進成纖維細胞增生而形成。Berg等[16]通過RT-PCR等檢測發現,當成纖維細胞與血小板相互作用1h后,前者5-LO蛋白表達明顯增加,成纖維細胞增生作用也明顯增強,當給予5-LO抑制劑5,6-dAA(5,6-Dehydro Arachidonic Acid)處理后,成纖維細胞增殖作用明顯受到抑制,表明5-LO介導血小板誘導成纖維細胞增殖過程。血管內皮細胞生長因子(Vascular Endothelial Cell Growth Factor,VEGF)在 AS形成中發揮重要作用,除了促進血管生成,還有利于斑塊形成,增加血管通透性,介導單核細胞黏附和趨化作用。Celletti等[17]用VEGF(2μg/kg)處理ApoE-/-/B100-/-小鼠,發現小鼠骨髓、外周血巨噬細胞水平、斑塊面積在處理后的第1、2、3周較對照組小鼠分別增加 5、14和4倍。Rome等[18]發現5-LO反義寡核苷酸能夠減少VEGF mRNA表達,并呈時間依賴性;當將5-LO cDNA轉染5-LO-/-細胞后,VEGF生成明顯增加,進一步研究發現,AA和5-羥-二十四碳四烯酸(5HETE)能夠促進VEGF基因表達和蛋白釋放。

免疫組化顯示在不穩定性斑塊以及容易破裂的斑塊纖維帽肩部,均有大量的5-LO表達,表明5-LO與AS斑塊穩定性有著密切聯系[21]。Cipollone等[22]發現在AS患者中,有臨床癥狀者粥樣硬化斑塊的5-LO表達水平較之無癥狀者明顯升高,基質金屬蛋白酶-2(Matrix Metalloproteinase-2,MMP-2)和MMP-9表達水平和活性水平均增加,并與5-LO表達明顯相關。Zhao等[23]研究發現,5-LO基因敲除小鼠動脈瘤形成明顯減少,免疫組化示MMP-2和巨噬細胞炎癥蛋白-1α(Macrophage Inflammatory Protein,MIP-1α)表達明顯下降。細胞外基質(Extracellular Matrix,ECM)金屬蛋白酶誘導劑通過激活磷脂酶A2(Phospholipase A 2,PLA 2)/5-LO途徑促進MMP-2分泌,導致斑塊不穩定性增加。

2.4 5-LO血管反應

腎素-血管緊張素軸是體內血管舒縮反應的主要調節軸。研究發現,5-LO途徑合成的 LTs通過相應受體介導,也參與血管舒縮反應。CysLTs主要分布在AS的平滑肌細胞、內膜發生增生處和斑塊形成區域,介導血管舒縮反應,并呈劑量依賴性,CysLTR1主要介導收縮信號,而CysLTR2主要介導舒張信號,至于最終的血管反應,主要看何種受體分布占優勢。Ishizaka等[19]發現血管緊張素II(Angiotensin,AngII)具有調節5-LO途徑成分LTA 4水解酶表達的作用,當利用微型真空泵持續輸注AngII 7天后,LTA4水解酶mRNA和蛋白表達水平較之對照組上調達3.5倍。Voelkel等[20]發現FLAP抑制劑M K-886能夠抑制 AngII引起的血管收縮效應,5-LO-/-小鼠左心肥大較之對照組小鼠明顯減少。這些研究均表明,5-LO途徑可能通過腎素-血管緊張素軸參與調節血管舒縮反應,在AS形成中發揮作用。

2.5 5-LO與細胞凋亡

長期以來,人們在腫瘤細胞的研究中發現,5-LO途徑產生5HETE和5-氧-二十四碳四烯酸(5-Oxo-Eicosatetraenoic Acid)對腫瘤細胞起促分裂作用,當阻斷5-LO信號途徑后,能夠阻斷腫瘤細胞生長,并促使其發生凋亡。在AS斑塊中心,組織細胞發生凋亡和壞死,導致斑塊壞死中心的形成,是斑塊遭受侵蝕和發生破裂的重要病理生理基礎。現代研究發現,5-LO能夠誘導凋亡介質表達,采用 5-LO抑制劑Zileuton或MK-886能夠明顯抑制巨噬細胞凋亡,但不能阻斷5-LO-/-巨噬細胞的凋亡,表明5-LO可能參與巨噬細胞凋亡過程。Maccarrone等[24]研究發現5-LO介導線粒體解耦聯過程有助于細胞發生凋亡,給予5-LO抑制劑能夠阻斷凋亡小體形成。此外,5-LO途徑產物LTB4、LTD4和5HETE均能增強TNF-α誘導的細胞凋亡效應。5-LO與AS斑塊中的巨噬細胞凋亡是否具有相關性,以及具體作用機制,尚待進一步研究。

3 小 結

總之,5-LO通過促進炎癥反應、改變斑塊穩定性、介導血管反應及細胞凋亡等過程參與AS形成,是認識并干預AS形成過程的新的路徑。但對其具體機制、調節方式及阻斷策略等有待進一步探索、研究,使之更有效地干預5-LO作用過程,減少AS的發生和發展。

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