菟仙海蚣膠囊對生精細胞損傷大鼠睪丸生精功能保護作用研究

張銀川,劉喜平

(1.定西市婦幼保健院,甘肅定西 743000;2.甘肅中醫學院,甘肅蘭州 730000)

少精、弱精癥是造成男性不育或生育力下降的主要原因,菟仙海蚣膠囊來源于筆者治療少精、弱精男性不育癥的驗方,由菟絲子、仙靈脾等 5味藥物組成。臨床應用表明,菟仙海蚣膠囊可增加少精、弱精患者精子密度、提高精子活力[1]。本研究觀察了菟仙海蚣膠囊對腺嘌呤致生精細胞損傷大鼠睪丸生精功能的保護作用,以期揭示其作用機制,為臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

SD大鼠,SPF級,雄性,3個月齡,體質量280～320 g,由甘肅中醫學院科研實驗中心提供,動物實驗設施使用證號SYXK(甘)2004～0006,實驗動物質量合格證號SCXK(甘)2004～0006。動物分籠飼養,食固體 SPF級飼料,自由飲水。飼料由北京市科奧協力飼料有限公司提供,合格證號為京動許字(2000)第 015號。室溫 20～25℃,相對濕度45%～52%。

1.2 藥品、試劑與儀器

菟仙海蚣膠囊由菟絲子、仙靈脾等 5味藥物按一定比例組成,由蘭州中藥現代化工程技術中心及甘肅中醫學院科研實驗中心監制,規格為0.35 g/粒(3.21 g生藥/g膠囊),實驗室時用生理鹽水配置成相應濃度的溶液。五子衍宗丸,北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠產品,批號 2009324。羧甲基纖維素鈉,河北省文安縣盛源纖維素廠產品,批號20090227;腺嘌呤,洛陽德勝化工有限公司產品,批號20080911;一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS),均為南京建成生物工程研究所產品,批號依次為 090612,090510;戊巴比妥鈉,中國醫藥集團上海化學試劑公司產品,批號 20030816。Tissue-Tek·VIPTM5Jr全封閉組織脫水機、Tissue-Tek·TECTM5組織包埋機及IVS-40推拉式切片機,均為日本櫻花電器株式會社產品;BH-2顯微鏡,日本OLYMPUS產品;R-200旋轉蒸發儀,瑞士BUCHI產品;BL150電子天平,北京Sartorius產品; KDC-2044低速冷凍離心機,科大創新股份有限公司中佳分公司產品。

1.3 動物分組與給藥

方法[2],將 72只 SD雄性大鼠適應性喂養 3～4 d后,隨機分為空白對照組、模型對照組、五子衍宗丸組及菟仙海蚣膠囊大、中、小劑量組 6組,每組 12只,分籠飼養,每籠 6只。空白對照組每天灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉10μL/g;模型對照組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉5μL/g,40min后灌胃5%的腺嘌呤混懸溶液(250μg/g)5μL/g;五子衍宗丸組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉5μL/g,40 min后灌胃24%的五子衍宗丸溶液5μL/g;菟仙海蚣膠囊大劑量組每天灌胃中藥浸膏5.4 g生藥/kg, 40min后灌胃5%的腺嘌呤混懸溶液(250μg/g) 5μL/g;菟仙海蚣膠囊中劑量組每天灌胃中藥浸膏2.7 g生藥/kg,40 min后灌胃5%的腺嘌呤混懸溶液(250μg/g)5μL/g。菟仙海蚣膠囊小劑量組每天灌胃中藥浸膏1.35 g生藥/kg,40min后灌胃5%的腺嘌呤混懸溶液(250μg/g)5μL/g。每天1次,實驗總持續時間為40 d。實驗期間每 7 d稱體質量1次,調整給藥量,每天每 100 g體質量大鼠的給藥總量為1mL。

1.4 檢測指標

1.4.1 睪丸組織形態學的變化及其損傷評分

將睪丸以10%甲醛液固定,石蠟包埋,切片,制片,脫臘,HE染色,封片。于光鏡下觀察曲精細管結構、計數生精上皮數、測量MSTD并顯微攝影,參考文獻方法[3],對睪丸組織結構進行評分。

1.4.2 睪丸組織NO與NOS變化

取一側睪丸,將睪丸表面的白膜去除;剪取0.3 g放于預先消毒過的平皿中;加入預冷的勻漿介質(0.01 mol/L Tris-HCl)共2 mL,用眼科小剪刀盡量剪碎組織,轉移至勻漿器制備勻漿;以另外1m L勻漿介質沖洗并轉移勻漿后的組織溶液置于一次性試管中,制成約10%(W/V,即0.1 g組織加1m L介質)的組織溶液;10 000 r/min低溫離心30min;取上清液按照試劑盒說明書用硝酸還原酶法檢測NO、NOS活性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 13.0統計分析軟件處理。計量資料數據以均數(BZ_139_2138_999_2156_1045)±標準差(s)表示,組間比較采用t檢驗。以 P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 菟仙海蚣膠囊對生精細胞損傷大鼠一般情況的影響

空白對照組大鼠精神、體征正常。模型對照組除 1只大鼠在造模灌胃過程中因操作不當而死亡外,其余大鼠出現明顯的腎陽虛癥狀如精神萎靡、蜷臥、反應遲鈍、少動、進食減少、豎毛、瞇眼、眼瞼周圍浮腫、耳廓蒼白、多尿等,且隨給藥天數的增加而加重。菟仙海蚣膠囊大、中、小劑量組大鼠體征較模型對照組為輕。

2.2 菟仙海蚣膠囊對生精細胞損傷大鼠睪丸組織病理形態學及損傷評分的影響

空白對照組睪丸組織曲細精管各級生精細胞發育正常、排列規整。模型對照組睪丸呈萎縮狀態,部分曲細精管退化變性,管腔內生殖上皮變薄,各級生精細胞數量減少。菟仙海蚣膠囊大劑量組異常曲細精管明顯減少,精子細胞較多見。五子衍宗組及菟仙海蚣膠囊中、小劑量組在低倍鏡下見典型的“斑點樣”改變;在高倍鏡下見部分曲細精管萎縮,精原細胞和支持細胞明顯減少,部分精子間質水腫,間質細胞空泡樣變性。見圖 1。

圖1 各組大鼠睪丸組織病理學HE染色切片(×200)

睪丸組織損傷評分結果見表 1。給予腺嘌呤溶液 40 d后,模型對照組睪丸與空白對照組在生精上皮層數、MSTD、睪丸組織結構評分上差別有統計學意義(P＜0.01);菟仙海蚣膠囊大劑量組在生精上皮層數、MSTD和組織結構評分上與模型對照組對比,差別有統計學意義(P＜0.01)。

表1 各組大鼠睪丸組織損傷評分對比 ±s

表1 各組大鼠睪丸組織損傷評分對比 ±s

注:與空白對照組對比,**P＜0.01;與模型對照組對比,#P＜0.05,##P＜0.01。

?

2.3 菟仙海蚣膠囊對生精細胞損傷大鼠睪丸組織NO及NOS的影響

見表3。模型對照組睪丸組織勻漿中NOS活性增強,NO含量增加,與空白對照組對比,差別有統計學意義(P＜0.01);菟仙海蚣膠囊大、中、小劑量均能對抗該效應,與模型對照組對比,差別有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)。表明菟仙海蚣膠囊具有降低睪丸織中異常升高的NOS活性、NO含量的作用。

表2 各組大鼠睪丸組織NO及NOS含量對比 ±s

表2 各組大鼠睪丸組織NO及NOS含量對比 ±s

注:與空白對照組對比,*P＜0.05,**P＜0.01;與模型對照組對比,#P＜0.05,##P＜0.01。

組 別劑量/g·kg-1 動物數NO /mmol·g-1 NOS /U·mg-1空白對照組 — 12 3.18±0.47 3.81±0.54模型對照組 0.25 11 5.96±0.70** 5.43±1.09**五子衍宗組 1.2 12 3.92±0.90## 4.59±0.89#菟仙海蚣大劑量組 5.4 12 3.87±0.55## 4.22±0.69#菟仙海蚣中劑量組 2.7 12 5.34±0.61# 4.62±0.67#菟仙海蚣小劑量組 1.35 12 5.66±0.68 4.99±0.79#

3 討 論

男性少精、弱精癥是造成男性不育或生育能力低下的重要原因,其病因復雜,尤其是特發性的精子減少或特發性弱精子原因不明。中醫學認為“腎藏精”、“主生殖”,腎之陰精是化生精液的物質基礎,其化生過程又賴腎陽的氣化作用,氣血條暢是腎之陰陽正常升降的前提。故腎虛精瘀是男性少精、弱精癥的重要病機,溫腎益精、活血通精法為其防治的基本治法。菟仙海蚣膠囊由菟絲子、蜈蚣等藥物組成,組方嚴謹,藥少力專,能溫腎益精、活血通精,使精出有源、精行通暢。腺嘌呤可誘導腎陽虛型睪丸功能損害[4],故本研究選用腺嘌呤建立大鼠生精細胞損傷動物模型。實驗結果顯示,給予腺嘌呤溶液后大鼠出現明顯的腎陽虛癥狀,菟仙海蚣膠囊可改善大鼠腎陽虛癥狀。

睪丸是性腺軸的靶器官,是精子發生的場所,睪丸曲細精管及間質細胞等組織的損傷,可導致生殖內分泌激素水平降低,并影響精液的數量與質量。本研究表明,經菟仙海蚣膠囊干預后,睪丸組織萎縮狀態得到一定程度的改善,異常曲細精管明顯減少,精原細胞和支持細胞較模型對照組明顯增多,精子細胞較多見。

精子發生是由分化較低的精原細胞發育成為高度分化精子的過程。NOS和NO對男性生殖功能具有重要調節作用,可調節睪丸的血液供應、激素的合理分泌,參與支持細胞、精子的正常發生及獲能,并影響精子的質量,從而影響男性的生殖功能。此外,低濃度的NO可促進精子活力、保護精子功能,而高濃度的NO則有抑制作用,可導致生精障礙,引起不育[5]。本研究表明腺嘌呤可誘發大鼠睪丸組織中NOS活性增強、NO含量增加,菟仙海蚣膠囊具有降低睪丸織中異常升高的NOS活性和NO含量的作用,從而促進精子活力、保護生精功能。

參考文獻:

[1]張銀川,徐瑛瑛,李蕊娜,等.菟仙海蚣膠囊治療少精、弱精癥的臨床觀察[J].甘肅中醫,2010,23(4):37-38.

[2]楊阿民,李曰慶,李海松,等.補腎生精丸對腺嘌呤所致生精細胞損傷模型大鼠的干預作用[J].北京中醫藥大學學報:中醫臨床版,2006,13(3):1-3.

[3]林孝坤,秦樂,陳肖鳴.環孢素對大鼠睪丸生精功能自身免疫反應損傷的保護作用[J].溫州醫學院學報,2009, 39(2):101-103.

[4]傅曉晴,林若勤,武一曼,等.腺嘌呤制作腎陽虛型慢性腎功能衰竭模型大鼠的生化研究[J].福建中醫學院學報,2003,13(1):22-24.

[5]康友敏,張健,李健,等.睪丸內 NO與NOS的研究進展[J].軍事醫學科學院院刊,2002,26(4):301-304.