四逆散干預實驗性潰瘍性結腸炎的藥效學研究 *

王麗娜,范 穎,盧 健,林庶茹

(1.遼寧中醫藥大學方劑教研室,遼寧沈陽 110032;2.遼寧中醫藥大學中醫分子生物學實驗室,遼寧沈陽 110032)

四逆散近年來被廣泛應用于消化系統疾病如內滯不通引起的胸脅苦滿、腹中脹痛或下利等的治療。潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)表現為腹痛、腹瀉、大便帶血,甚或黏液膿血便、里急后重等,屬于中醫學“泄瀉”、“痢疾”、“滯下”等范疇,與四逆散治療病證相符。目前有關四逆散原方治療UC的實驗研究尚未見報道。本實驗旨在探討四逆散對實驗性UC大鼠的藥效學影響,以期初步揭示其干預實驗性UC的機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級SD大鼠40只,體質量160～180 g,雌雄各半,一次性購于上海西普爾 -必凱實驗動物有限公司,合格證號為SCXK(滬)-20080016。

1.2 藥品、試劑與儀器

四逆散組由柴胡免煎顆粒(批號0909165)、白芍免煎顆粒(批號0909053)、枳實免煎顆粒(批號0909086)、炙甘草免煎顆粒(批號 0909050)組成,均由江陰天江藥業有限公司提供;固腸止瀉丸由西安阿房宮藥業有限公司提供(批號092440),為中藥對照藥。多聚甲醛,國藥集團化學試劑有限公司產品,批號F20090722;完全弗氏佐劑,美國SIGMA公司產品,批號096K89031;生理鹽水;75%酒精;PBS緩沖液等。BL610型電子天平,北京賽多利斯儀器系統有限公司產品;飛鴿牌TDL-5-4型離心機,上海安亭科學儀器廠產品;DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機,寧波新芝生物科技股份有限公司產品;OLYMPUS顯微鏡,日本TKO光學儀器株式會社產品; RM2145型切片機及 H 11210型烤片機,均為德國徠卡儀器有限公司產品。

1.3 模型的建立

參照文獻方法[1]加以改良。取新鮮家兔的結腸黏膜制成黏膜勻漿,冷凍24 h;溶凍后以4 000轉/min的速度離心30 min;取上清液提純,根據Low ry法測定蛋白含量;含量達標后置于冰箱保存備用;使用時與等量完全弗氏佐劑配成抗原乳化液。除正常對照組外,其余每組于造模第 1天注射抗原乳化液,分別注射于大鼠的雙側足跖、雙側腹股溝及背部,每只0.5 m L;第10,17 d依同法注射等量抗原乳化液。

1.4 分組與給藥

按體質量將 40只大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、固腸止瀉丸組、四逆散組4組,每組 10只,雌雄各半。各組均按 10μL/g體質量的濃度配備灌胃藥物。正常對照組、模型對照組按1.00mg/(g·d)蒸餾水灌胃,其他兩組造模同時于第 2天給予藥物處理。各組藥物按臨床成人用量的 6.3倍折算實驗大鼠的用量,分別為中藥對照組按1.4 mg/(g·d)固腸止瀉丸溶液灌胃,四逆散組按1.75mg/(g·d)四逆散溶液灌胃。

1.5 取材方法

于給藥后 20 d處死大鼠,摘取動物脾臟、胸腺稱量質量,并計算其脾臟、胸腺指數。取距肛門約10 cm處病變最明顯結腸組織,沿腸系膜縱向剪開,以生理鹽水沖凈腸管壁,將結腸剖開、展平,使黏膜表面向上,對其進行肉眼觀察,并按結腸黏膜損傷程度評分標準評分。于病變部位取材,置于 4%多聚甲醛溶液中固定,常規石蠟包埋切片,HE染色,光鏡觀察,并且按照結腸病理組織學評分標準進行評分。

1.6 檢測指標

1.6.1 一般情況

實驗期間觀察各組大鼠精神狀態、活動度、毛色光澤度及疏密度、大便性狀、飲食飲水情況、死亡情況等。記錄大鼠體質量變化,每周稱質量1次以調整給藥量。

1.6.2 脾臟、胸腺指數

根據以下公式計算。脾臟指數(mg/10 g)=脾臟質量×100/體質量,胸腺指數(mg/10 g)=胸腺質量 ×100/體質量。

1.6.3 肉眼下結腸組織損傷程度

肉眼觀察結腸黏膜損傷情況,按結腸組織形態學評分標準(見表 1)評定結腸黏膜損傷積分。

表1 結腸組織形態學評分標準

1.6.4 光鏡下結腸組織損傷程度及形態學變化

病理切片觀察用常規的HE染色法。光鏡下觀察結腸組織損傷情況,參考組織學損傷評分[3],包括潰瘍炎癥肉芽腫,纖維化有無、輕、重(有無、輕、重分別計為0,1,2分)及病變損害深度(至黏膜下層 1分,至肌層 2分,至漿膜層3分),各項相加即為總分。

1.7 統計學方法

采用SPSS 15.0統計分析軟件處理。計量資料數據以均數(BZ_139_2138_999_2156_1045)±標準差(s)表示,組間均數比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 四逆散對UC大鼠一般情況的影響

造模前,各組大鼠精神狀態良好,毛發緊密且有光澤,反應靈敏,較活躍,飲食飲水正常,大便正常。模型對照組大鼠出現形體消瘦,精神萎靡,有拱背、扎堆現象,毛發較疏松無光澤,肛周被污染,有不同程度的腹瀉,部分大鼠可見肉眼少量血便。四逆散組及固腸止瀉丸組大鼠的上述癥狀和體征有明顯改善。

2.2 四逆散對UC大鼠脾臟指數、胸腺指數的影響

與正常對照組對比,模型對照組、固腸止瀉丸組、四逆散組大鼠脾臟指數升高,差別有統計學意義(P＜0.01);模型對照組大鼠胸腺指數降低,差別有統計學意義(P＜0.05)。與模型對照組對比,固腸止瀉丸組、四逆散組大鼠脾臟指數及胸腺指數均升高,差別有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)。四逆散組與固腸止瀉丸組兩指標對比,差別無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 各組大鼠脾臟指數和胸腺指數對比mg·10-1·g-1,±s

表2 各組大鼠脾臟指數和胸腺指數對比mg·10-1·g-1,±s

注:與正常對照組對比,*P＜0.05,**P＜0.01;與模型對照組對比, #P＜0.05;##P＜0.01。

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2.3 四逆散對UC大鼠結腸組織損傷程度的影響

與正常對照組對比,模型對照組、固腸止瀉丸組、四逆散組大鼠結腸組織損傷程度評分及病理組織學評分增高,差別均有統計學意義(P＜0.01)。與模型對照組對比,固腸止瀉丸組、四逆散組大鼠結腸組織損傷程度評分以及結腸病理組織學評分降低,差別均有統計學意義(P＜0.01)。四逆散組與固腸止瀉丸組兩指標對比,差別無統計學意義(P＞0.05)。見表 3。

表3 各組大鼠結腸損傷程度對比 ±s

表3 各組大鼠結腸損傷程度對比 ±s

注:與正常對照組對比,**P＜0.01;與模型對照組對比,##P＜0.01。

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2.4 四逆散對UC大鼠結腸組織形態學的影響

正常對照組大鼠結腸黏膜上皮細胞完整、連續,固有層腺體排列規整,無水腫、增生、充血,無潰瘍、糜爛點及細胞浸潤。模型對照組黏膜表面可見潰瘍形成,重者可達肌層,炎癥反應較重,有充血糜爛,細胞浸潤,黏膜上皮部分缺失,局部固有層腺體減少,黏膜肌層不明顯。固腸止瀉丸組黏膜小凹變淺,固有層腺體減少。四逆散組黏膜層、黏膜肌層清晰,黏膜小凹正常。見圖 1。

圖1 各組大鼠結腸組織病理學HE染色切片(×100)

3 討 論

有學者認為,脾臟指數和胸腺指數的改變能夠反映機體免疫功能的狀態[4-5]。有關 UC動物模型脾臟指數改變的報道不一,多數研究結果表明UC大鼠脾臟指數明顯降低[6],亦有研究證明 UC大鼠脾臟指數增加[7]。本實驗發現,模型對照組大鼠脾臟指數明顯高于正常對照組,此可能是由于機體免疫功能紊亂,炎性細胞浸潤,發生感染而致。經四逆散治療后,UC大鼠脾臟、胸腺指數均顯著升高,提示四逆散可能具有促進UC大鼠脾臟和胸腺免疫功能恢復的作用,亦驗證了四逆散可正向調節免疫抑制狀態機體的免疫功能,對機體免疫功能有促進和調節的作用[8]。

從結腸標本兩大評分比較得出,模型對照組大鼠結腸損傷程度明顯重于正常對照組,四逆散組大鼠的結腸損傷程度明顯輕于模型對照組,差別均有統計學意義。觀察UC大鼠結腸黏膜病理形態學發現,采用四逆散干預治療后,病變組織黏膜層、黏膜肌層清晰,黏膜小凹正常,未見炎性滲出,說明結腸黏膜病變組織已得到有效的修復。由此可初步得出,四逆散能有效改善 UC大鼠的一般狀況和病理損害,具有減輕 UC大鼠結腸炎性以及潰瘍病變的效用。此亦驗證了四逆散的抗潰瘍作用[9-10]。

本實驗證明,四逆散能夠有效治療實驗性大鼠UC,其作用機理可能與提高UC大鼠的免疫功能、減輕UC大鼠病理損傷程度有關。衛生出版社,1991:1161.

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