重組人促紅細胞生成素體外誘導人臍靜脈內皮細胞血管新生作用的實驗研究

姚曉艷,李紅戈

華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院,武漢430022

促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)以往被認為主要由胎肝及成人腎臟產生,作用僅限于調節紅細胞生成。近期研究發現,EPO在中樞神經系統亦有表達,并受氧供的調控[1]。EPO可促進血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達[2,3],提示其可能是一種新的促血管生成因子,參與血管新生。內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide synthase,eNOS)激活產生的內皮細胞源性一氧化氮是重要的血管重塑因子[4]。eNOS是否參與 EPO調節內皮細胞的血管新生過程目前尚不十分清楚。本研究以內皮細胞株為研究對象,觀察重組人促紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin,rH-EPO)對缺血缺氧損傷內皮細胞的血管新生作用,及該作用與VEGF和eNOS間關系,以探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①細胞株：人臍靜脈內皮細胞株(EA.hy926),由華中科技大學同濟醫學院公共實驗平臺細胞庫提供。②主要試劑與材料：高糖DMEM培養基(購于Gibco公司);胎牛血清(購于杭州四季青公司);無糖Earle's液、rH-EPO(購于沈陽三生公司);5 mg/mL噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、8 μ m 孔徑 Transwell聚碳酸酯膜(購于Corning公司);去生長因子Matrigel(購于BD公司);人VEGF酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒(購于深圳達科為公司);Trizol試劑、逆轉錄試劑盒(購于Invitrogen公司);實時(Real-time)PCR試劑盒(購于TOYOBO公司);兔抗人eNOS多克隆抗體(購于Santa Cruz公司);辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(購于武漢博士德公司);引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基,37℃、5%CO2培養箱培養,細胞貼壁生長,每2天換液1次,待細胞融合約80%時傳代。取對數生長期細胞用于以下實驗。……