硫化氫抑制小膠質細胞內β-淀粉蛋白的毒性作用

硫化氫（H2S）作為內源性氣體信號分子，對阿爾茨海默病（AD）病理過程的影響尚不清楚。AD是最常見的神經變性疾病，以胞外β淀粉蛋白（Aβ）沉積物積聚和腦內大量神經原纖維纏結為特征。目前認為Aβ的可溶性聚集物可能在AD發病機制中起關鍵作用。已有實驗證實，小膠質細胞的激活可能在Aβ沉積和神經元變性之間起關聯作用。小膠質細胞的活化可以產生并釋放某些促炎癥因子，表明小膠質細胞活化在AD中具有重要作用。因此，H2S是否在Aβ激活小膠質細胞的過程中發揮作用值得探討。

本實驗以BV-2細胞和原代培養的小膠質細胞為研究對象。處理組細胞用β淀粉樣多肽（Aβ1-40）孵育24 h；預處理+ Aβ1-40組的細胞分別用不同濃度的硫氫化鈉（NaHS，H2S的外源性供體）溶液、S-腺苷蛋氨酸（SAM）、SB203580（p38抑制劑，1 μmol/L）、JNK抑制因子Ⅱ（JNK抑制劑，50 μmol/L）預處理30 min，而后與Aβ1-40（25 μmol/L）共孵育24 h。噻唑藍（MTT）還原測定結果表明，Aβ1-40可明顯抑制BV-2細胞的MTT生成，而NaHS在25～500 μmol/L范圍內可呈濃度依賴性減弱Aβ1-40的這種抑制效應。200 μmol/L NaHS的抑制效應最顯著，說明H2S具有抗Aβ1-40損傷的細胞保護作用。Aβ1-40處理后，BV-2細胞內乳酸脫氫酶（LDH）的活性可提高56.4%。該效應可明顯被200～500 μmol/L的NaHS抑制，提示H2S可通過降低細胞膜通透性保護Aβ1-40引起的細胞損傷。生長抑制DNA損傷蛋白（GADD153）的功能是阻斷細胞周期由G1期進入S期。蛋白免疫印記分析顯示，用Aβ1-40處理細胞24 h后，GADD153的表達量是未處理前的1.9倍。這種上調效應可被50～100 μmol/L的NaHS預處理減弱，提示Aβ能抑制細胞周期再循環，而H2S可對抗此作用。用2 μmol/L的Aβ1-40處理BV-2細胞24 h能明顯刺激NO的生成。50～500 μmol/L的NaHS可呈濃度依賴性抑制Aβ1-40的促NO生成效應。且500 μmol/L的NaHS抑制效應最顯著。胱硫醚-β-合成酶（CBS）是膠質細胞內生成H2S的主要酶。筆者使用CBS的激動劑—SAM來驗證內源性H2S的作用。實驗發現NaHS（100 μmol/L）和SAM（100 μmol/L）均有抑制NO生成的效應。Aβ上調BV-2細胞內誘導型NOS（iNOS）的表達。這種上調效應可被NaHS（100 μmol/L）或SAM（100 μmol/L）減弱。提示H2S可通過抑制Aβ的促iNOS表達作用而發揮抗炎效應。Aβ能明顯促進BV-2細胞內腫瘤壞死因子（TNF）-α的生成。外源性NaHS可濃度依賴性抑制Aβ的促TNF-α生成效應。BV-2細胞經Aβ處理不同時間后發現，15 min時Aβ開始促進絲裂原活化蛋白激酶p38（p38 MAPK）磷酸化，2 h達高峰，直到處理細胞24 h，Aβ仍有促進磷酸化效應。100～500 μmol/L的NaHS可明顯降低由Aβ所致的p38 MAPK活性。Aβ作用于BV-2細胞15 min時即可誘導JNK蛋白激酶磷酸化，隨即達高峰并持續在高磷酸化狀態。100～500 μmol/L的NaHS可明顯降低由Aβ所致的JNK活性。Aβ作用1 h后能明顯促進ERK活性，此后至作用6 h，活性逐漸降低。至用作24 h，ERK活性恢復正常。用100～500 μmol/L的NaHS預處理30 min不影響Aβ作用1 h后的ERK磷酸化水平。表明H2S的細胞保護作用與抑制JNK和p38活性有關，而與ERK無關。環氧化酶（COX）-2是類前列腺素形成的重要生物調節劑。本研究發現Aβ能顯著上調COX-2。這種上調效應可被H2S抑制。表明H2S可通過抑制Aβ促類前列腺素生成的抗炎效應來發揮細胞保護功能。

總之，無論是BV-2細胞還是原代培養的小膠質細胞，H2S均可降低BV-2細胞內Aβ的細胞毒性，減少GADD153的表達，抑制小膠質細胞內Aβ誘導的NO和TNF-α表達，減少Aβ上調蛋白COX-2的表達，降低Aβ誘導的p38/JNK MAPKs活性。綜上，H2S具有治療神經退行性疾病的潛在價值。

（李戰永摘 楊卓審校 譯自JAlzheimersDis,2010,22:1189-1200）