PI3K/Akt信號轉導通路與卵巢癌順鉑耐藥相關性的研究

張 棟 孔德璇 和珍珍 瞿全新

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路是一個經典的抗凋亡、促存活的信號轉導途徑，在腫瘤發生、增殖、侵襲、轉移及放化療抵抗中發揮重要作用。PI3K/Akt通路異常與卵巢癌的發生、發展有關，PI3K抑制劑聯合傳統化學療法可能是一種有效抑制腫瘤生長和腹水產生的方法[1]。腫瘤細胞對順鉑（DDP）的獲得性和先天性的耐藥是DDP類化療藥抗腫瘤的一個最大障礙[2]。本研究利用LY294002抑制PI3K/Akt通路，探討PI3K/Akt通路在卵巢癌DDP耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）細胞系：人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細胞順鉑敏感株SKOV3，由天津醫科大學免疫學實驗室提供；人卵巢癌漿液性乳頭狀囊腺癌細胞DDP耐藥株SKOV3/DDP，購自北京市腫瘤醫院藥物研究所。（2）儀器與試劑：一抗（PI3K兔抗人單克隆抗體、Akt兔抗人單克隆抗體）購自長沙嘉美生物公司；一抗（β-actin兔多克隆抗體）購自美國Santa Cruz公司；二抗（HRP-標記山羊抗兔IgG）購自北京中杉金橋生物技術有限公司，LY294002購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 S KOV3、SKOV3/DDP細胞于37℃、5%CO2、含10%小牛血清的RPMI 1640培養基中培養。LY294002作用前后SKOV3、SKOV3/DDP細胞DDP半數抑制濃度值（IC50）實驗分組。（1）LY294002作用組：將2種細胞分別置于LY294002濃度為40 μmol/L的培養基中，調節細胞濃度為1.0×105/mL，加入96孔板中，每孔180 μL培養4 h后取出，棄掉培養基，每孔加入含10%小牛血清的RPMI 1640培養基180 μL。配制各濃度DDP，每孔加入20 μL DDP，使DDP終質量濃度分別為 1 00.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56及0.78 mg/L，每一濃度設4個平行孔。同時設立對照孔（只含等體積細胞懸液，不加藥物）、空白調零孔（只含等體積完全培養基，不加藥物）培養72 h。（2）LY294002作用前組：調節2種細胞濃度為1.0×105/mL，加入96孔板中，每孔180 μL，培養4 h后取出，加入各濃度DDP，方法同上，培養72 h。

檢測細胞PI3K/Akt蛋白表達實驗分組。（1）LY294002各濃度組：25 cm2細胞培養瓶培養2種細胞，待細胞生長至70%~80%匯合時，加入LY294002，配制成濃度為5、10、20及40 μmol/L，培養4 h后加入DDP，使DDP在SKOV3細胞中的終質量濃度為3.5 mg/L，在SKOV3/DDP細胞中的終質量濃度均為14.0 mg/L，分別接近其IC50。（2）DDP組：取DDP終質量濃度為SKOV3細胞3.5 mg/L、SKOV3/DDP細胞14.0 mg/L。（3）對照組：正常培養條件下的SKOV3和SKOV3/DDP細胞。以上細胞經處理后均培養24 h。

1.2.2 MTT法檢測LY294002作用后SKOV3和SKOV3/DDP對DDP敏感性的影響 9 6孔細胞板每孔加入20 μL MTT溶液（5 g/L），培養箱中孵育4 h，棄掉培養基，每孔加100 μL二甲基亞砜（DMSO）振蕩5 min，用酶標儀在570 nm處測定吸光度值（A）。計算各組細胞的抑制率。實驗重復3遍，取平均值。細胞生長抑制率=（1-加藥組A值/對照組A值）×100%。根據各組DDP濃度和抑制率，計算兩者的回歸系數a、b，代入公式：Y=a+blnX，計算細胞DDP IC50值。耐藥倍數=（SKOV3/DDP細胞DDP IC50值）（/SKOV3細胞DDP IC50值）。

1.2.3 Western blot檢測SKOV3和SKOV3/DDP細胞PI3K、Akt及β-actin表達 每 瓶細胞使用400 μL含苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解緩沖液提取細胞總蛋白。蛋白上樣量為20 μL ，進行電泳、轉膜、封閉后，1∶500比例加入一抗，孵育、洗膜，以1∶5 000加入二抗后孵育、洗膜、顯影。膠片經Bio-Rad成像分析軟件Quantity One分析結果，將目的蛋白與相應內參蛋白（β-actin）條帶灰度值之比作為目的蛋白相對濃度。實驗重復3次，取平均值。

1.3 統計學方法 采 用SPSS 10.0軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LY294002作用前后SKOV3、SKOV3/DDP細胞對DDP的敏感性 LY294002作用前后各濃度DDP對SKOV3、SKOV3/DDP細胞生長抑制率，見表1。LY294002作用前：SKOV3細胞DDP的IC50（3.309 4±0.177 1）mg/L；SKOV3/DDP 細 胞 DDP 的 IC50為（13.630 7±0.934 2）mg/L，耐 藥 倍 數 為 4.12。LY294002作用后：SKOV3細胞DDP IC50為（1.080 2±0.062 1）mg/L，與LY294002作用前相比DDP IC50差異有統計學意義（t=20.57，P<0.001），SKOV3細胞經LY294002作用后對DDP敏感性增加了67.36%；SKOV3/DDP細胞DDP的IC50為（3.194 9±0.194 1）mg/L，與LY294002作用前相比差異有統計學意義（t=18.94，P<0.001），SKOV3/DDP細胞經LY294002作用后對DDP敏感性增加了76.56%。

表1 LY294002作用前后各濃度DDP對細胞生長的抑制作用 （%，±s）

表1 LY294002作用前后各濃度DDP對細胞生長的抑制作用 （%，±s）

0.78 1.56 3.13 6.25 12.50 25.00 50.00 100.00 7.71±1.05 35.66±3.49 49.64±1.25 81.10±1.85 89.78±1.28 91.19±1.02 91.93±0.92 94.04±2.36 28.17±2.80 57.47±2.06 68.67±2.80 92.40±0.89 95.71±0.99 97.00±0.87 96.70±0.76 97.55±0.37 4.59±1.17 9.05±0.53 13.04±1.38 19.49±1.38 43.33±2.34 71.51±2.40 86.72±2.72 89.63±1.29 20.06±1.74 28.86±4.11 39.97±1.07 70.46±4.12 87.46±1.25 90.37±0.71 93.79±1.27 95.45±1.19 SKOV3細胞抑制率作用前 作用后 作用前 作用后SKOV3/DDP細胞抑制率DDP（mg/L）

2.2 LY294002、DDP對SKOV3細胞中PI3K、Akt表達的影響 PI3K蛋白在LY294002各濃度組的表達量不同，且進一步組間兩兩比較差異均有統計學意義（均P<0.001)；Akt蛋白在LY294002各濃度組的表達量不同，差異有統計學意義（P<0.001)，進一步組間比較LY294002 5＋DDP組與DDP組間差異無統計學意義（P=0.488)，其他組間比較差異均有統計學意義（組間比較①∶②、①∶⑥、②∶⑤、⑤∶⑥P分別為0.038、0.006、0.011、0.019，其余組間比較均P<0.001），見表2。

2.3 LY294002、DDP對SKOV3/DDP細胞中 PI3K、Akt表達的影響 LY294002各組間PI3K蛋白的表達量不同，兩兩比較差異均有統計學意義（①∶②、⑤∶⑥P分別為0.005、0.004，其余組間比較均P<0.001）；各組間Akt蛋白表達兩兩比較差異均有統計學意義（均P<0.001），見表3。

2.4 SKOV3和SKOV3/DDP細胞中PI3K和Akt表達 SKOV3細胞對照組PI3K和Akt蛋白相對濃度值均低于SKOV3/DDP細胞對照組，差異均有統計學意義（t分別為26.005和23.477，均P<0.05），見表2、3。

表2 SKOV3細胞中PI3K及Akt表達水平 （ ±s）

表2 SKOV3細胞中PI3K及Akt表達水平 （ ±s）

**P<0.01；表3同

Akt 1.211 4±0.026 6 1.139 5±0.034 7 0.898 7±0.063 2 0.592 2±0.025 3 1.233 3±0.025 0 1.303 5±0.046 9 150.510**PI3K 0.715 6±0.030 2 0.626 9±0.017 1 0.510 0±0.018 0 0.366 3±0.005 2 0.796 6±0.003 9 0.879 7±0.034 8 276.341**組別LY294002 5+DDP①LY294002 10+DDP②LY294002 20+DDP③LY294002 40+DDP④DDP⑤對照組⑥F

表3 SKOV3/DDP細胞中PI3K及Akt表達水平（±s）

表3 SKOV3/DDP細胞中PI3K及Akt表達水平（±s）

組別LY294002 5+DDP①LY294002 10+DDP②LY294002 20+DDP③LY294002 40+DDP④DDP組⑤對照組⑥F PI3K 1.313 1±0.012 5 1.226 2±0.010 9 1.046 4±0.019 0 0.808 8±0.029 4 1.553 5±0.058 4 1.446 9±0.014 7 236.437**Akt 1.735 7±0.013 4 1.579 7±0.018 5 1.372 7±0.039 5 1.030 0±0.009 5 2.143 2±0.002 9 1.974 3±0.015 8 1217.000**

3 討論

PI3K/Akt信號轉導通路可能通過以下幾種途徑在卵巢癌的發生發展中起重要作用。（1）基因異常。PI3K CA的擴增、突變，PI3K CA基因編碼PI3K的P110 α亞基，位于染色體3q26，人類許多惡性腫瘤組織中可見到該染色區域的異常擴增，PI3K CA基因擴增與卵巢癌發生有關。Levine等[3]對198例晚期卵巢上皮癌組織中編碼P13K CA高度保守區域的EXON9和EXON20進行基因測序，發現其中24例（12%）發生突變。在原發性卵巢癌中，PI3K調節亞單位p85α編碼基因的突變，導致ser608位點自動調節區域臨近位點與SH2之間的序列丟失，PI3K處于持續活化狀態，引起腫瘤發生。研究證實在一些卵巢癌組織中，Akt2基因發生擴增和過表達與腫瘤發生有關，并預示著預后不良[4]。（2）Akt表達異常。Noske等[5]發現58%原發性卵巢癌中存在Akt過表達，且與卵巢癌的臨床分期及淋巴結轉移相關，運用RNA干擾降低Akt表達能夠抑制卵巢癌細胞增殖。

卵巢癌的耐藥機制目前還不完全清楚，研究表明，Akt能夠通過磷酸化其下游的多種作用底物促進腫瘤細胞的生長、增殖；抑制細胞凋亡；提高細胞的缺氧耐受；促進血管生成；促進腫瘤細胞侵襲、轉移；促進對化療和放療的抵抗[1]。Zhang等[6]發現下調Akt表達可輔助抗腫瘤治療。Peng等[7]發現Akt/mTOR通路的激活可以阻止DDP對卵巢癌細胞的凋亡作用并且引起卵巢癌細胞發生DDP耐藥。Fraser等[8]發現Akt可以通過抑制p53的磷酸化和細胞核功能導致人卵巢癌細胞發生DDP耐藥。Weng等[9]研究發現下調Akt2可以增加卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性,但目前對PI3K/Akt信號轉導通路與多藥耐藥產生和逆轉關系的研究仍較少。

本研究結果表明，SKOV3/DDP細胞中PI3K/Akt蛋白表達水平高于SKOV3細胞，以LY294002抑制PI3K/Akt蛋白表達可增強SKOV3細胞DDP敏感性，特別是在SKOV3/DDP細胞，對DDP敏感性達到其親本（SKOV3細胞）水平，提示PI3K/Akt信號通路異常與卵巢癌DDP耐藥有關，抑制PI3K/Akt信號通路能逆轉卵巢癌DDP耐藥表型。

[1]Page C,Lin HJ,Jiny,et al.Overexpression of Akt/Akt can modulate chemotherapy-induee apoptosis[J].Anticancer Res,2000,20(1A):407-416.

[2]Brozovic A,Ambriovic-Ristov A,Osmak M.The relationship be?tween cisplatin-induced reactive oxygen species,glutathione,and BCL-2 and resistance to cisplatin[J].Crit Rev Toxicol,2010,40(4):347-359.

[3]Levine DA,Bogomolniy F,Yee CJ,et al.Frequent mutation of gene PI3KCA in ovarian and breast cancers[J].Clin Cancer Res,2005,11(8):2875-2878.

[4]Balsara BR,Pei J,Mitsuuchi Y,et al.Frequent activation of Akt in non-small cekk lung carcinomas and preneoplastic bronchial le?sions[J].Carcimpgenesis,2004,25(11):2053-2059.

[5]Noske A,Kaszubiak A,Weichert W,et al.Specific inhibition of AKT2 by RNA Interfeernce resμLts in reduction of ovarian cancer cell proliferation:Increased expression of AKT in advanced ovarian cancer[J].Cancer Lett,2006,235(1):25-30.

[6]Zhang HY,Zhang PN,Sun H.Aberration of the PI3K/AKT/mTOR signaling in epithelial ovarian cancer and its implication in cisplat?in-based chemotherapy[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2009,146(1):81-86.

[7]Peng DJ,Wang J,Zhou JY,et al.Role of the Akt/mTOR survival pathway in cisplatin resistance in ovarian cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,394(3):600-605.

[8]Fraser M,Bai T,Tsang BK.Akt promotes cisplatin resistance in hu?man ovarian cancer cells through inhibition of p53 phosphorylation and nuclear function[J].Int J Cancer,2008,122(3):534-546.

[9]Weng D,Song X,Xing H,et al.Implication of the Akt2/survivin pathway as a critical target in paclitaxel treatment in human ovarian cancer cells[J].Cancer Lett,2009,273(2):257-265.