自體外周血干細(xì)胞對肝硬化患者肝纖維化的改善作用

董 毅,朱太崗,張飛虎,葛 曦,湯繼春,李月紅,劉連成

肝硬化是臨床常見病、多發(fā)病,該病進(jìn)入失代償期后逐漸發(fā)展,最終可能導(dǎo)致肝功能衰竭。雖然肝臟移植取得了一定的效果,可是供移植的肝臟來源有限,況且器官移植的費用之高也令患者望而卻步。目前臨床上主要仍以保肝對癥及預(yù)防并發(fā)癥為主,終末期肝病的治療總體效果不甚理想,因此尚需探討新的治療方法[1]。近年來骨髓干細(xì)胞移植治療已在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了令人矚目的成就,也為終末期肝病的治療提供了新方法,自體干細(xì)胞移植不存在免疫排斥及倫理問題,是一種具有廣闊應(yīng)用前景的有效治療手段。現(xiàn)將我院開展的自體外周血干細(xì)胞治療對肝硬化患者的肝纖維化改善情況作一分析報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇 2009年 9月～2010年 10月我院接受自體干細(xì)胞治療的肝硬化住院患者 35例,男 25例,女 10例,年齡 24～63歲,中位年齡 51歲。其中肝炎后肝硬化 30例,酒精性肝硬化4例,血吸蟲性肝硬化1例,肝功能Child-Pugh A級5例,B級 20例,C級 10例,患者治療前均明確診斷肝硬化[2]。設(shè)常規(guī)治療的肝硬化患者 20例為(B組)對照組。2組病例在性別、年齡分布、治療前各項檢測指標(biāo)經(jīng)檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義,均有可比性。所有接受干細(xì)胞治療患者均簽署知情同意書。

1.2 手術(shù)方法 2組患者入院后均行內(nèi)科對癥治療。A組在此基礎(chǔ)上給予粒細(xì)胞集落刺激因子 400μg,皮下注射,連續(xù) 4 d,第 5天行外周血干細(xì)胞采集,單個核細(xì)胞計數(shù) 1.2×108/ ml～3.1×1010/m l,在DSA下經(jīng)股動脈穿刺插管,置管于肝固有動脈進(jìn)行造影,觀察肝內(nèi)血管情況及有無占位性病變,將干細(xì)胞細(xì)胞懸液經(jīng)肝固有動脈緩慢注入,術(shù)畢拔管,穿刺點加壓包扎后返回病房,穿刺側(cè)下肢制動 8 h,常規(guī)使用抗感染及對癥治療3 d。

1.3 觀察指標(biāo) 分別于治療后第 8周、24周觀察患者肝纖維化指標(biāo)[透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)]及肝臟影像學(xué)檢查。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件分析結(jié)果,數(shù)據(jù)以ˉx± s表示,組間比較定量資料根據(jù)方差齊性采用t或t′檢驗,治療前后比較采用配對t檢驗,分類資料采用χ2檢驗,P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組治療前后肝纖維化指標(biāo)變化情況 見表 1～表 3。

2.2 肝臟B超檢查 治療前肝臟縮小,肝表現(xiàn)凹凸不平,呈結(jié)節(jié)狀,彌漫性回聲增強(qiáng),分布不均勻。肝內(nèi)血管粗細(xì)不均勻,血管扭曲、閉塞而看不到,尤以肝靜脈明顯,其主干變細(xì),分支狹窄。門靜脈由于血流受阻主干、右支及左支矢狀部增粗,門靜脈主干內(nèi)徑＞10mm,脾靜脈內(nèi)徑大于 8mm。治療后24周可見肝臟增大,實質(zhì)回聲致密,回聲增強(qiáng)增粗。

3 討論

肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞的活化,活化的肝星狀細(xì)胞分泌組織金屬蛋白酶抑制劑增加,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解減少,使細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)沉積。肝纖維化及肝硬化是多種慢性肝病的終末期病理表現(xiàn),目前傳統(tǒng)的治療手段難以從根本上修復(fù)肝臟的不可逆變化,肝移植是治療各種終末期肝病的最有效方法。然而,由于供體來源不足、操作復(fù)雜、移植后免疫排斥和治療費用昂貴等問題,限制了臨床肝移植的發(fā)展。相比之下,細(xì)胞移植則具有來源廣泛、創(chuàng)傷性小及可重復(fù)進(jìn)行等優(yōu)點,其中骨髓干細(xì)胞近年來被認(rèn)為是最具治療潛力的供體細(xì)胞。薛永杰等[3]對 152例經(jīng)肝穿刺確診為慢性乙型肝炎及肝硬化患者,應(yīng)用放射免疫法檢測血清透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝臟病理炎癥及纖維化分級與血清纖維化指標(biāo)的水平有顯著相關(guān)性,組間對比部分有統(tǒng)計學(xué)意義,炎癥分級組較為明顯。因此檢測血清纖維化指標(biāo)的水平對于判斷肝臟炎癥及纖維化程度有一定價值和意義。

表1 2組治療前肝纖維化指標(biāo)變化情況(±s)

表1 2組治療前肝纖維化指標(biāo)變化情況(±s)

組別 HA(μg/m l) LN(μg/L) PCⅢ(μg/L)Ⅳ-C(ng/m l) A組 708.2±124.7 181.8±72.6 203.4±71.3 150.2±68.4 B組 722.1±114.2 193.3±98.4 224.9±104.8 148.8±78.3

表2 2組治療8周肝纖維化指標(biāo)變化情況(±s)

表2 2組治療8周肝纖維化指標(biāo)變化情況(±s)

組別 HA(μg/m l) LN(μg/L) PCⅢ(μg/L)Ⅳ-C(ng/m l) A組 512.5±115.7 143.8±86.5 176.4±98.4 112.1±62.6 B組 711±125.7 184.2±84.7 211.4±114.7 141.3±74.7

表3 2組治療24周肝纖維化指標(biāo)變化情況(±s)

表3 2組治療24周肝纖維化指標(biāo)變化情況(±s)

注：治療前A組與B組比較,P＞0.05;A組治療前與治療后 8周比較,P＜0.05,與治療后24周比較,P＜0.01,A組治療后8周與治療后24周比較,P＜0.01;B組治療前后比較,P＞0.05。

組別 HA(μg/m l) LN(μg/L) PCⅢ(μg/L)Ⅳ-C(ng/m l) A組 245.2±84.7 103.9±74.2 118.0±75.3 74.1±35.3 B組 708.3±123.5 195.5±90.7 222.7±95.4 158.3±66.2

干細(xì)胞是具有自我更新、高度增值和多向分化潛能的細(xì)胞群體,主要包括造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞[4-5]。雖然數(shù)量非常少,但卻有強(qiáng)大的自我更新能力,并可以定向或橫向分化為多種組織細(xì)胞或組織前體細(xì)胞,如造血細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、Ⅱ型肺泡細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等。也正是因為干細(xì)胞具備了該種特性才使其向肝細(xì)胞分化成為可能。干細(xì)胞治療肝病的巨大應(yīng)用潛力有 3種細(xì)胞可能參與成體肝臟細(xì)胞的更新與修復(fù),前 2種為處于分化終點的成熟肝細(xì)胞和肝前體細(xì)胞,但研究表明移植這兩種細(xì)胞存在來源缺乏、治療效果欠佳、免疫排斥等問題,這就需要第三類細(xì)胞,即來源于骨髓的多能干細(xì)胞。它的特點有：向肝細(xì)胞分化的多能性和專能性,強(qiáng)大的增殖能力,取材容易、損傷小、易于自體移植、無移植排斥反應(yīng),臨床應(yīng)用前景非常突出。

肝硬化的預(yù)后取決于患者的營養(yǎng)狀況、有無腹水、血清膽紅素和白蛋白水平以及凝血酶原時間,還與病因、年齡和性別有關(guān)。一般說來,病毒性肝炎引起的肝硬化預(yù)后較差,年齡大者,男性預(yù)后較差,如再出現(xiàn)肝腎綜合征、肝性腦病、并發(fā)食管靜脈大出血、嚴(yán)重感染等則病情危重,預(yù)后極差。內(nèi)科保守治療主要有：調(diào)整飲食與營養(yǎng),還應(yīng)補(bǔ)充足夠的微量元素,保護(hù)肝功能,促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù),補(bǔ)充蛋白質(zhì),體育鍛煉,禁戒煙、酒,慎用各類保肝藥,嚴(yán)禁使用能夠損害肝臟的藥物,但總體療效欠佳[6-7]。肝硬化往往因并發(fā)癥而死亡,如何改善患者的預(yù)后,提高生存率,尚需探討新的治療措施。

近年來,關(guān)于干細(xì)胞在肝纖維化治療中的研究越來越多。相關(guān)資料顯示,干細(xì)胞除了有可以分化為肝細(xì)胞的潛能外,還可以通過表達(dá)高水平的MMPs,尤其是MMP-9來減少肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[8]。外周血干細(xì)胞進(jìn)入肝內(nèi)分化為肝細(xì)胞肝細(xì)胞板的修復(fù)可以減少肝內(nèi)炎癥反應(yīng),肝內(nèi)的炎癥因子減少,對肝星形細(xì)胞的激活減弱,對肝內(nèi)纖維組織形成具有抑制作用。外周血干細(xì)胞可能通過細(xì)胞間信號傳導(dǎo)來促進(jìn)肝星形細(xì)胞凋亡及促進(jìn)肝內(nèi)纖維組織降解酶類的產(chǎn)生,使肝內(nèi)纖維組織形成和降解的平衡趨于纖維組織降解的方向,促進(jìn)肝纖維化的恢復(fù)。

骨髓干細(xì)胞在臨床應(yīng)用領(lǐng)域廣泛,已取得一定療效[9-10]。近年來國內(nèi)外關(guān)于干細(xì)胞治療肝病的應(yīng)用越來越多,Kumar等[11]報告了原發(fā)淀粉樣變性合并進(jìn)行性肝衰竭,成功進(jìn)行干細(xì)胞移植,術(shù)后隨訪 28個月,未出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)的臨床征象。姚鵬等[12]行肝動脈介入分別將分離的自體骨髓干細(xì)胞移植入肝衰竭患者的肝臟,結(jié)果患者癥狀明顯改善,轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素和血氨水平明顯下降,而白蛋白和凝血酶原活動度逐漸上升,未見嚴(yán)重并發(fā)癥。許多報道得出類似的結(jié)果[13]。可見經(jīng)肝動脈途徑移植自體干細(xì)胞治療晚期肝病療效確切且副作用小,安全,能夠促進(jìn)患者肝功能改善。

我院采用外周血干細(xì)胞治療肝硬化,在全密閉環(huán)境下采集,用一次性耗材,與骨髓采集相比減少污染的機(jī)會,且無痛,干細(xì)胞數(shù)量能達(dá)到治療的要求,單個核細(xì)胞計數(shù) 1.2×108/ml～3.1×1010/ml。在DSA下經(jīng)股動脈穿刺插管,盡量置管于肝固有動脈,觀察肝內(nèi)血管情況及有無占位性病變,將干細(xì)胞細(xì)胞懸液緩慢注入。治療后患者的自覺癥狀改善較明顯,觀察全部 35例患者,第 8周肝纖維化指標(biāo)較治療前好轉(zhuǎn),但改善不明顯,第24周肝纖維化指標(biāo)明顯改善。肝臟B超檢查發(fā)現(xiàn)治療后 24周可見肝臟增大,實質(zhì)回聲致密,回聲增強(qiáng)增粗。未發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥,近期無不良反應(yīng)出現(xiàn)。且發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞治療對肝纖維化的改善方面Child-Pugh B級患者改善明顯,A級稍差,C級較差。由此可見該療法優(yōu)先用于 B級患者。外周血干細(xì)胞治療肝病的優(yōu)點：避免肝臟移植和肝細(xì)胞移植的排斥反應(yīng)。避免長期服用免疫抑制劑帶來的負(fù)反應(yīng),早期利用骨髓修復(fù)肝損傷、改善遺傳性缺陷組織的功能以及代替退行性組織,可極大地延長生存期,回避了對胚胎干細(xì)胞應(yīng)用的倫理爭議,細(xì)胞來源獲取方便且治療費用低廉。可見骨髓干細(xì)胞移植治療肝衰竭,可在一定程度上恢復(fù)肝功能,縮短治療時間,改善預(yù)后。探索與驗證干細(xì)胞移植治療晚期肝病的新方法和新思路,為解決干細(xì)胞移植時細(xì)胞來源、患者的選擇及合理移植途徑等關(guān)鍵問題是有必要的。

目前,肝纖維化治療仍是一大難題,骨髓干細(xì)胞移植為眾多肝纖維化甚至肝硬化患者帶來了曙光,被認(rèn)為是最具應(yīng)用前景的措施之一,但其作用機(jī)制尚不完全清楚,需要深入研究和探討。盡管在實驗研究中取得了可喜成果,但關(guān)于干細(xì)胞的臨床研究還相對比較缺乏,因此,還需要更全面更完善的臨床研究設(shè)計方案的出現(xiàn)。

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