地塞米松對(duì)大鼠腦出血后周?chē)X組織MMP-9表達(dá)的影響

王善軍,王道奎,王玉亭,閆瑞云

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)是一組降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分子的鋅、鈣依賴(lài)性的中性蛋白酶類(lèi),在神經(jīng)系統(tǒng)中MMP-9最為重要,Gursoy-Ozdemir等[1]發(fā)現(xiàn)血漿蛋白的滲漏與腦水腫形成同時(shí)發(fā)生,而在沒(méi)有MMP-9的老鼠中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)滲漏,由此推測(cè)大鼠ICH腦水腫的形成可能與MMP-9的形成及ECM的降解有關(guān)。DEX作為臨床上常用的控制腦水腫的輔助用藥,其療效已為大多數(shù)醫(yī)生所接受,然而其對(duì)物質(zhì)代謝、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等諸多方面的負(fù)面影響又不容忽視,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)從DEX與MMP-9表達(dá)的影響方面入手,研究DEX對(duì)控制腦水腫的可能的作用通道,從而為副作用小、效果更好的DEX替代藥物的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠,由濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房代購(gòu)于山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司(許可證號(hào)：scxk魯20080002),體重 310～380 g,隨機(jī)分為A、B、C 3組;大鼠腦立體定向儀(ZH-藍(lán)星B型)、100μl微量注射器、手術(shù)器械包、MMP-9-抗(北京中杉)、PV 9003試劑盒(北京中杉)、DAB試劑盒等。

1.2 方法 (1)分組：63只雄性Wistar大鼠,隨機(jī)分為A組(DEX干預(yù)組)21只;B組(模型組)21只;C組(對(duì)照組)21只,分別按照時(shí)間點(diǎn)6 h、12 h、24 h、3 d、5 d、7 d、14 d分為7個(gè)亞組,每組 3只。(2)建立大鼠腦出血模型：參照Xue等[1]方法,以前囟前0.2mm,中線右旁開(kāi)3mm,垂直進(jìn)針5.5mm,為大鼠右側(cè)基底節(jié)區(qū);斷尾取血 50μl,以微量注射器緩慢注入腦內(nèi)定位的位置。(3)取材、包埋、切片分別于各時(shí)間點(diǎn)大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后,以頸總動(dòng)脈灌注固定,4%多聚甲醛固定 24～48 h后制成蠟塊,切片后 60℃烤箱 1～2h后備用。

1.3 MMP-9檢測(cè) 按照說(shuō)明書(shū)對(duì)MMP-9采用PV 9003試劑盒進(jìn)行檢測(cè),DAB顯色,陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色,每張切片在高倍鏡(×400)下選取 3個(gè)不同視野,記錄每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),取平均值作為陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以±s表示。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)做統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

MMP-9主要分布于神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜及胞漿中,胞膜及胞漿被染成棕褐色。對(duì)照組：血腫周?chē)X組織僅見(jiàn)少量MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞;模型組：6h可見(jiàn)少量的散在的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá),24 h陽(yáng)性細(xì)胞開(kāi)始明顯增多,第 3天達(dá)到高峰,到第14天時(shí)仍有少量表達(dá);DEX干預(yù)組：6 h可見(jiàn)較少陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá),同樣在24h開(kāi)始迅速增多,第 3天達(dá)到高峰,后逐漸下降, 14 d時(shí)仍可見(jiàn)少量的MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞。DEX干預(yù)組、模型組、對(duì)照組之間兩兩比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DEX干預(yù)組12 h、24h、3 d、5 d、7 d時(shí)間點(diǎn)MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),6 h、14 d時(shí)DEX干預(yù)組與模型組相比差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見(jiàn)表 1;3組各時(shí)間點(diǎn)具體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)見(jiàn)表 2。

表1 各組在各時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較的P值

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(±s)

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(±s)

組別 例數(shù) 6h 12h 24h 3d 5d 7d 14d DEX干預(yù)組 21 2.815±2.734 13.259±7.547 19.778±6.265 36.037±8.682 23.000±7.063 12.037±7.109 3.259±2.510模型組 21 6.408±5.328 28.296±4.920 36.963±6.330 65.333±13.314 48.444±7.409 26.333±11.371 2.555±2.075對(duì)照組 21 1.593±1.690 2.037±1.111 1.778±1.364 2.704±1.911 1.852±1.375 1.148±1.056 1.481±1.144

3 討論

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是臨床常見(jiàn)病,作為預(yù)后最差的卒中類(lèi)型[2-3]在我國(guó)發(fā)病比例遠(yuǎn)高于歐美,約占全部腦卒中的 30%[4],其發(fā)病率、致殘率和病死率均較高。腦水腫是ICH后最重要并發(fā)癥之一,其產(chǎn)生和發(fā)展是導(dǎo)致ICH患者病情惡化或死亡的主要原因之一,臨床上能否有效控制腦水腫成為治療腦出血成功與否的重要指標(biāo),對(duì)腦出血患者的病程及療效產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。故深入研究腦出血后水腫的形成機(jī)制并結(jié)合相應(yīng)機(jī)制通道給予積極、有效的治療,降低其致殘率、病死率成為目前臨床治療腦出血需要迫切解決的問(wèn)題。近年來(lái)在腦出血后腦水腫形成機(jī)制方面的研究取得了一定的成果。研究發(fā)現(xiàn),腦出血后水腫是細(xì)胞毒性水腫和血管源性水腫的共同結(jié)果,其作用機(jī)制包括,液體靜力壓和血凝塊回縮、凝血酶原的產(chǎn)生和激活、血紅蛋白的毒性作用、補(bǔ)體激活、炎性反應(yīng)損傷和血腦屏障開(kāi)放等。其中血腦屏障(b loodbrain barrier,BBB)破壞對(duì)繼發(fā)腦水腫形成的作用,受到越來(lái)越多的重視。

血腦屏障(BBB)主要由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管基底膜以及膠質(zhì)細(xì)胞足突構(gòu)成。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellar matrix, ECM)分子如Ⅳ型膠原、層粘蛋白和纖維連接蛋白等構(gòu)成的基膜是維持BBB完整的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),直接決定著B(niǎo)BB的通透性,如果其遭受破壞,將使血管通透性增加,導(dǎo)致血管源性腦水腫。

地塞米松作為重要的控制腦水腫的輔助用藥,藥理作用廣泛,具有抗炎、抗免疫、抗毒素、抗休克作用,廣泛應(yīng)用于臨床,控制腦水腫的作用被大多數(shù)研究人員所認(rèn)同,已有學(xué)者[5]認(rèn)為其作用機(jī)制是通過(guò)減少炎癥因子的生成,從而減輕血腦屏障的破壞來(lái)減輕腦水腫的 ,具體的作用通道及機(jī)理各研究卻不統(tǒng)一,Hyongbum Kim等[6]認(rèn)為地塞米松是通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成素 1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的,而 GU YT等[7]認(rèn)為是通過(guò)減少AQP-4的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,近年來(lái)MMP-9在血腦屏障破壞及繼發(fā)性腦水腫方面的研究日益受到重視。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分子的鋅、鈣依賴(lài)性的中性蛋白酶類(lèi),在神經(jīng)系統(tǒng)中MMP-9最為重要,Rosenberg等[8]在細(xì)菌膠原酶誘導(dǎo)的大鼠ICH模型上發(fā)現(xiàn),模型大鼠24 h腦組織含水量和MMP-9含量增加,并伴有富含Ⅳ型膠原的腦血管床基膜的破壞,MMPs抑制劑(tissue inhibitor ofmetalloproteinase,TIMPs)能顯著降低細(xì)菌膠原酶注射部位周?chē)X組織的含水量。Gursoy-Ozdemir等[9]發(fā)現(xiàn)血漿蛋白的滲漏與腦水腫形成同時(shí)發(fā)生,而在沒(méi)有MMP-9的老鼠中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)滲漏,由此推測(cè)大鼠 ICH腦水腫的形成可能與MMP-9的形成及ECM的降解、BBB基底膜的破壞有關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外研究多集中在 MMP-9與血腦屏障破壞及腦水腫的關(guān)系上,藥物干預(yù)對(duì)MMP-9在腦出血時(shí)周?chē)X組織中表達(dá)的影響的研究較少。

本實(shí)驗(yàn)DEX干預(yù)組與模型組之間在12h、24h、3 d、5 d、7 d時(shí)間點(diǎn)MMP-9陽(yáng)性表達(dá)的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),說(shuō)明DEX對(duì)MMP-9的表達(dá)有影響,能夠減少M(fèi)MP-9的表達(dá),這與DEX減輕腦水腫的作用過(guò)程相一致,因此我們認(rèn)為DEX減輕腦水腫與MMP-9作用通道有關(guān)。14 d時(shí)3組之間差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),說(shuō)明DEX對(duì)MMP-9表達(dá)的影響主要集中在7 d以?xún)?nèi)。因此我們認(rèn)為,從MMP-9作用通道來(lái)看, DEX用于控制水腫為目的時(shí),應(yīng)該控制在發(fā)病后 7 d內(nèi),發(fā)病7 d以后,特別是 14 d以后應(yīng)用已無(wú)臨床意義。

綜上所述,我們推測(cè) DEX減輕腦水腫是通過(guò)減輕血管源性腦水腫和細(xì)胞中毒性腦水腫兩個(gè)方面實(shí)現(xiàn)的,可能的作用機(jī)理為：(1)特異性抑制生物活性物質(zhì)(如MMP-9等)的生成,從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的溶解、破壞,從而降低血腦屏障的通透性;(2)非特異性抗炎作用,通過(guò)阻斷炎癥級(jí)聯(lián),減少炎癥因子的生成及活化,減輕細(xì)胞的炎癥反應(yīng),從而減輕腦出血后繼發(fā)性損傷;(3)增加細(xì)胞間連接的緊張度,從而減輕細(xì)胞間隙內(nèi)水分的聚集;(4)穩(wěn)定細(xì)胞膜的離子通道,增強(qiáng)鈉-鉀泵等在維持細(xì)胞內(nèi)外離子分布中的作用;具體的作用機(jī)制及其他主要的作用靶點(diǎn)有待于進(jìn)一步地研究。

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