纖維素分解菌的選育及在糞便堆積發酵中最佳生長條件的研究*

吳皓瓊， 牛彥波， 曹亞彬， 郭立姝， 殷 博

（黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010）

目前對畜禽糞便的處理主要包括物理法、化學法和生物法三大類。生物發酵處理法是近年來國內外研究較多的一種方法。該法具有成本低、發酵產物生物活性強、肥效高、易于推廣等特點，同時可達到除臭、滅菌的目的，因而被認為是最有前途的一種畜禽糞便處理方法。在固體發酵畜禽糞便過程中，由于廢棄物中含有大量纖維素，因此，加強纖維轉化為腐殖質便成為發酵充分腐熟的關鍵。微生物是產生纖維素酶的主要來源，在發酵的過程中發揮了巨大的作用。細菌、放線菌和霉菌都能夠產生纖維素分解酶，常作為接種劑加速糞肥等物料細胞壁和木質素、纖維素水解，促進腐殖化過程。其中分解纖維素的真菌主要有曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)和鐮刀菌屬(Fusarium)的一些種。在發酵過程中，真菌對發酵物料的分解和穩定起著重要作用[1－5]。本研究從采集的畜禽糞便和土樣中,對纖維素分解菌進行了篩選,同時對篩選出的纖維素分解菌與解磷巨大芽孢桿菌、細黃鏈霉菌等組合形成復合菌劑（另文發表）在糞便堆積發酵中最佳生長條件進行研究，旨在篩選出具有高酶活的纖維素分解菌并形成高效復合菌劑，加快纖維素的降解，提高糞肥堆積發酵速度與質量。

1 材料與方法

1.1 材料

省內采集的畜禽糞便和土樣共計7個，用于纖維素分解菌的篩選。發酵試驗用牛糞取自黑龍江省發酵工程技術中心。經成分分析：牛糞全氮含量為1.18﹪，全磷含量為0.48%，有機質（干基）38.5%，水分75.7%。復合菌劑由篩選出的纖維素分解菌和解磷巨大芽孢桿菌、細黃鏈霉菌等復合形成，本所生產。

1.2 培養基

羧甲基纖維素培養基：CMC-Na 15g，NH4NO31.0g,酵母膏1.0g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO4·3H2O 1.0g，H2O 1000mL，pH自然，瓊脂15g,121℃、30min蒸汽滅菌。

赫奇遜培養基：KH2PO4·3H2O 1.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl20.1g，NaCl 0.1g，FeCl30.01g，NaNO32.5g，H2O 1000 mL，pH 7.0,121℃、30min蒸汽滅菌。

纖維素剛果紅培養基：KH2PO4·3H2O 0.5g,MgSO4· 7H2O 0.25g,微晶纖維素1.88g，明膠2g，剛果紅0.2g，土壤浸出液100 mL，H2O 900 mL，瓊脂15g，pH 6.5，121℃、30min蒸汽滅菌。

纖維素瓊脂培養基：（NH4）2NO32g，MgSO4·7H2O 1.0g，CaCO32g，NaCl 1.0g，H2O 1000 mL，瓊脂15g，pH 7.0，121℃、30min蒸汽滅菌。

純化培養基(PDA培養基)：馬鈴薯汁20%,蔗糖20g,瓊脂15g,水1000 mL，121℃、30min蒸汽滅菌。

固體曲培養基：無霉變米糠粉、麩皮（過60目篩），加適量無菌水，調節水分至50%左右，pH自然，121℃、60min蒸汽滅菌。

察氏培養基：蔗糖3.0g，NaNO33.0g，MgSO4· 7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，K2HPO41.0g，瓊脂15.0g，H2O1000 ml，pH自然。

1.3 方法

1.3.1 纖維素分解菌的分離與純化（初篩）

將樣品采用“彈土法”點接于羧甲基纖維素培養基平板上,置28℃培養,挑選出在平板上生長快、透明圈大的培養物；將樣品稀釋到適宜程度（一般情況下10－1～10－3）,吸取1mL稀釋液,用纖維素剛果紅培養基制成混菌平板,置28℃培養,挑選出在平板上生長快、紅色濃郁且水解圈大的培養物；將樣品接種于內放濾紙條的赫奇遜培養液中,置28℃培養5～7d,挑選出將濾紙條分解斷裂快的培養物。

將挑選出的以上培養物在PDA培養基上多次劃線和用稀釋平板法篩選出單個菌落,結合鏡檢,反復多次,直至純化為單菌株。

1.3.2 不同菌株對濾紙分解能力的測定（復篩）

采用濾紙失重率法：將選出的菌株單株或混合株分別接種于以濾紙為唯一碳源的選擇性培養基中，28℃、120r/min搖床培養，觀察濾紙的崩解效果,以“+”的多少來表示濾紙崩解程度,“+”越多,說明該菌株的降解效果越強。

用濾紙過濾發酵液，將殘留物80℃烘干稱重，用減重法計算出濾紙失重率。

計算公式：濾紙失重率S（%）＝（A－B）／A× 100%

其中：A-初始濾紙重，gB-殘留濾紙重，g。1.3.3不同菌株對羧甲基纖維素分解能力的測定（復篩）

將分離的單個菌株及其混合菌分別點種于羧甲基纖維素培養基平板上,28℃培養3d,測透明圈直徑。并計算酶相對活性：

式中:A為相對活性；d為透明圈直徑；t為培養時間。

1.3.4 纖維素酶的測定

1.3.4.1 接種與培養

將固體曲培養料121℃、60min蒸汽滅菌，冷卻至35℃左右,搶溫接種待測菌株懸液。置30℃靜止培養,每24h取樣測纖維素酶活。

1.3.4.2 粗酶液的制備

稱2.0g發酵曲,加蒸餾水20 mL，30℃水浴1h，每15min搖勻一次，3000r/min離心5min，取上清液為粗酶液。

1.3.4.3 纖維素酶活的檢測

用3,5二硝基水楊酸(DNS)比色法，測定還原糖含量來確定FPA、CMC、C1三種纖維素酶活。

FPA濾紙酶活的測定：緩沖液2.0 mL,加入1× 6cm新華濾紙一張,50℃預熱5min后加入0.5 mL酶液,50℃保溫1h,取出加2.5 mLDNS試劑,煮沸5min,冷卻后加水5 mL,540nm處測定還原糖。

CMC酶活的測定（內切葡聚糖酶）：2.0 mL含5% CMC的緩沖液,50℃預熱5min后加0.5 mL酶液,其余操作同FPA酶活的測定。

C1酶活測定：2.0 mL緩沖液中加入50mg脫脂棉,50℃預熱5min后加入0.5 mL酶液,50℃保溫24h,其余操作同FPA酶活的測定。

酶活單位U:采用國際制單位,即在上述條件下，每分鐘產生1μmol葡萄糖的酶量為一個單位。酶活力即扣除參比溶液中還原糖后,每毫升酶液中所含酶活單位的量。

1.3.5 菌株鑒定

參考《伯杰氏系統細菌學手冊》、《真菌鑒定手冊》進行鑒定。

1.3.6 復合菌劑在糞便堆積發酵中最佳生長條件的研究

以牛糞為實驗對象，在實驗室模擬條件下，將牛糞自然風干至含水量50%以下，去除大塊雜質，磨碎待用，按L9(34)正交設計各因素水平用稻殼粉、2%麥飯石粉、水等調節物料的C/N比以及水分、pH值后，高溫滅菌，置于中號醫用搪瓷盤中，上覆塑料薄膜保水，28℃±1℃培養，培養2d后，進行翻堆，4d測定活菌數。每處理3次重復，均等取樣混合測定各數值。活菌數的測定參見農業部微生物肥料標準NY884-2005進行。正交設計各因素水平見表1。

表1 復合菌劑在堆積發酵中最佳生長條件 L9(34)正交設計Table 1 L9(34)optimal growth conditions ofcomplexbacteriumin the compostingfermentation

2 結果與分析

2.1 纖維素分解菌菌種篩選及對濾紙、羧甲基纖維素分解能力的分析

對7種樣品進行系統分離，初篩獲得約20株菌，通過對菌落形態、生長速度的觀察以及分解纖維素能力判定，挑選其中3株用PDA培養基平板進行分離純化得到單個菌株B1、F1、F2。單個菌株B1、F1、F2以及它們相互混合對濾紙、羧甲基纖維素分解能力見表2、表3。從表2、表3可以看出：各菌株單獨培養對濾紙、羧甲基纖維素均有一定的分解效果,但不如混合的效果好,B1、F1、F2混合培養8d時，濾紙失重率達到58.06%、酶相對活性0.93±0.00 cm·d-1，由此說明，3株菌株混合可以增加酶活力，各菌之間有很好的協同效應。

表2 不同培養時間的濾紙失重率/%Table 2 Weight loss offilter paper in different culture time

表3 不同菌株的纖維素酶相對活性及對濾紙的分解效果Table 3 The relative activityofcellulose and the decomposition effect of filter paper on different strains

2.2 纖維素分解菌酶活分析

結果見表4。從表4可見：B1、F1、F2菌株在固體曲中,都能很好地生長,隨著培養時間的延長,酶活力提高，在培養5～6d時,酶活力達到最高。各菌株的FPA酶活力是B1F1F2＞B1＞F1＞F2；CMC酶是F1＞B1F1F2＞B1＞F2；C1酶是B1＞B1F1F2＞F1＞F2。各菌混合后FPA酶活力顯著增加，與各菌對濾紙、羧甲基纖維素分解能力的試驗結果相吻合，進一步了證明菌種間的協同增效作用。基于酶活力大小的比較及生產成本的考慮，選擇B1、F1菌作為堆肥發酵的試驗生產菌。

表4 不同菌株固體曲的纖維素酶活分析 單位:U/mlTable 4 The cellulose activityofthe solid curve ofdifferent strains

2.3 菌株的鑒定

B1、F1菌株生長迅速，在察氏培養基上28℃培養7d，直徑7～8cm，菌絲初期為白色，后期呈綠色，產孢叢束區擺列成同心輪紋，培養基背面成無色，培養基顏色不改變。分生孢子從菌絲的側枝上生出，直立，分枝，小枝對生，頂端不膨大，上生分生孢子團，分生孢子球形，淺色或無色。F2菌株生長迅速，在察氏培養基上28℃培養7d，直徑7～8cm，菌絲初期為白色，后期呈青綠色，培養基背面呈無色，培養基顏色不改變。營養菌絲有隔膜，分生孢子梗從菌絲垂直生出，孢梗頂端不膨大，分枝一次，頂端為小梗，分生孢子串成不分枝的鏈狀，單個孢子球形，卵圓形，綠色。

根據各菌株的菌落特征和形態特征，按真菌分類鑒定手冊和真菌分類學進行檢索，初步認為B1、F1為木霉(Trichoderma),F2為青霉(Penicillium)。

2.4 復合菌劑在糞便堆積發酵中最佳生長條件的研究

以牛糞為研究對象，在實驗室模擬條件下，采用L9(34)正交設計，研究物料水分、C/N、起始pH及接種量對復合微生物菌株生長的影響，結果見表5、表6。

表5 沼渣堆積發酵工藝條件的確定Table 5 Determination ofthe conditions ofcompostingfermentation ofbiogas residues

表6 沼渣堆積發酵工藝條件正交試驗方差分析（完全隨機模型）Table 6 Orthogonal analysis ofvariance on the conditions ofcomposting fermentation ofbiogas residues(completelyrandommodel)

從表5、表6可以看出,對微生物生長的影響各因素按極差大小主次順序為:B＞A＞D＞C，表明物料的C/N的比例對復合菌劑活菌數（生長）影響最大，物料pH影響最小。FB=38.29743＞F0.05=19,達顯著水平，表明B因素影響顯著，所以對該因素應控制在最優水平上,A、D、C因素對復合菌劑活菌數（生長）對結果影響不大。綜合以上分析，得到最佳堆積發酵工藝條件A2B3C1D2，即物料C/N為35、水分60%、接種量5%、pH=8.0。在此工藝條件下，適合菌劑中的微生物 生 長 繁 殖 ，活 菌 數 達 到 40.12×108cfu/g。

[1]蔡建成.堆肥工程與堆肥工廠[M].北京:機械工業出版社，1990.

[2]郭德憲，曹健，鮑宇茹.利用生物技術降解纖維素的研究進展［J］.鄭州工程學院學報，2001，2(3):82～86.

[3]劉克峰，劉悅秋，雷增普.幾種微生物應用于豬糞堆肥中的研究[J].北京農學院學報，2001,16(2):36～41.

[4]趙永勛，張洪全，張躍華.微生物菌劑對有機廢棄物發酵作用的研究[J].佳木斯大學學報(自然科學版)，2001，19(2):183～186.

[5]楊朝暉,曾光明,蔣曉云,等.城市垃圾堆肥過程中的生物學問題[J].微生物學雜志，2005,25(3):57～61.