磷酸鹽對高效產(chǎn)氫菌種BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.發(fā)酵產(chǎn)氫性能的影響和調(diào)控*

李永峰， 陳 紅， 韓 偉， 王占青， 徐菁利

(1.上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海201620；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

石化能源在過去的幾個世紀(jì)主宰著人類的生活，19世紀(jì)70年代的產(chǎn)業(yè)革命以來，石化燃料的消費(fèi)量急劇增長，進(jìn)入20世紀(jì)以后(特別是第二次世界大戰(zhàn)以來)石油和天然氣的生產(chǎn)與消費(fèi)持續(xù)上升，隨著科技的發(fā)展和社會生活水平的提高，人們對能源的需求量也與日俱增，據(jù)統(tǒng)計世界上最近25年內(nèi)能源的消耗量相當(dāng)于過去100年的消耗[1]，如今能源的消耗量已成為衡量人們生活水平和文明程度的一個重要標(biāo)志。

然而過去對石化能源粗放型的使用，造成了現(xiàn)在十分惡劣的環(huán)境污染，溫室效應(yīng)和酸雨等環(huán)境問題的出現(xiàn)導(dǎo)致了人類生態(tài)環(huán)境的惡化，并嚴(yán)重的影響到社會經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展和人類的生存；同時石化能源的儲量越來越少，據(jù)估算，以目前的儲量和開采程度，石油僅能維持50～80年，煤炭也只能維持200～300年左右[2-3]，因此高效、清潔的二次能源的開發(fā)已成為全世界研究的熱點(diǎn)課題。

氫氣作為一種清潔的可再生能源，由于具有燃燒時不放出CO2等溫室氣體、燃燒熱值高、儲存運(yùn)輸方便等優(yōu)勢從眾多替代能源中脫穎而出[4-5]，成為研究重點(diǎn)。氫氣的制取有很多種，包括甲烷裂解、水電解、光合法制氫以及發(fā)酵法制氫等。厭氧發(fā)酵生物制氫技術(shù)與傳統(tǒng)的制氫方法相比，由于其不依靠光源就能持續(xù)進(jìn)行、不消耗化石能源、產(chǎn)氫率更穩(wěn)定高效、反應(yīng)器的設(shè)計與運(yùn)行更簡便易操作等眾多優(yōu)點(diǎn)，它的另一個亮點(diǎn)在于厭氧發(fā)酵的微生物可以利用高濃度的有機(jī)廢水和生物質(zhì)(如復(fù)合固體廢棄物、陰溝底泥等)作為它的底物，這既可以解決環(huán)境問題又能產(chǎn)生潔凈能源—?dú)錃鈁6-7]。

營養(yǎng)是生命活動的起始點(diǎn)，它為一切生命活動提供了必須的物質(zhì)基礎(chǔ)[8]。磷是微生物細(xì)胞合成核酸、核蛋白、磷脂及其他含磷化合物的重要元素，幾乎所有微生物可將無機(jī)磷酸鹽作為磷源而直接利用；磷在糖代謝磷酸化過程中起關(guān)鍵性作用，因此在培養(yǎng)基中添加該元素可以促進(jìn)微生物的生長與發(fā)育；同時磷酸鹽對于發(fā)酵生物制氫系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行起著重要的作用，它可以作為緩沖劑來減小細(xì)菌培養(yǎng)初期較大的pH值波動。在產(chǎn)氫厭氧消化過程中，揮發(fā)性脂肪酸伴隨著氫氣的產(chǎn)生而產(chǎn)生，如果不定時的從培養(yǎng)基中排出這些有機(jī)酸，則會嚴(yán)重的影響著培養(yǎng)液pH值的穩(wěn)定性，揮發(fā)性脂肪酸和堿度之間平衡失調(diào)會導(dǎo)致氫氣產(chǎn)生的中斷，因此必須通過投加碳酸鹽或磷酸鹽來提高系統(tǒng)的抗酸堿沖擊性。

本實(shí)驗旨在探索研究磷酸鹽對純培養(yǎng)制氫系統(tǒng)氫氣生產(chǎn)的影響，從而提高純菌種發(fā)酵產(chǎn)氫的效能，為純菌種連續(xù)流發(fā)酵產(chǎn)氫奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

本實(shí)驗采用的菌種為本實(shí)驗室從活性污泥里提取的高效產(chǎn)氫菌種BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.[9](菌種鑒定的國際DNA數(shù)據(jù)庫登記號為AF363375)，其透射電鏡照片如圖1所示，Biohydrogenbacterium R3sp.nov.為革蘭氏陽性菌，不形成芽孢，桿菌；大小為0.3～0.5 μm×1.5～2.0μm；周生鞭毛，且鞭毛較長；形成的菌落呈現(xiàn)白色或乳白色，20～30d可以長成至直徑為1.0～2.5mm，菌落邊緣整齊，圓形，光滑，不透明；類脂粒4～6個，異染粒2～3個。

實(shí)驗時采用LR-HPB培養(yǎng)基[10]，其成份如下:葡萄糖20.0 g/L；胰蛋白胨1.0 g/L；蛋白胨3.0 g/L；牛肉膏 2.0 g/L；酵母汁 1.0 g/L；NaCl3.0 g/L；K2HPO41.0 g/L；L-半胱氨酸0.5 g/L；維生素液與微量元素（抗壞血酸0.025 g/L；葉酸0.01 g/L；NiCl2· 6H2O 0.001 g/L；CaCl2·2H2O 0.01 g/L；ZnCl20.02 g/L）10ml；刃天青（0.2%）1ml。

圖1 菌株BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的透射電鏡照片/20000×Fig.1 TEM images/20000×ofBiohydrogenbacteriumR3sp.nov.

1.2 間歇實(shí)驗

實(shí)驗以150ml的錐形瓶作為反應(yīng)器 (如圖2所示)，各培養(yǎng)瓶中分別加入100 mL培養(yǎng)液，純菌種BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.接種量為1 mL。將反應(yīng)瓶放入恒溫汽浴振蕩器中，溫度 (35±1)℃、轉(zhuǎn)速120 r/min下培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液的起始pH值調(diào)節(jié)為6.0。為保證厭氧條件，整個裝瓶、接種過程均在高純氮吹脫下進(jìn)行。

圖2 間歇反應(yīng)器裝置Fig.2 Experimental apparatus of hydrogen production reactor

本次實(shí)驗分為兩部分，第一部分研究了K2HPO4對BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.發(fā)酵產(chǎn)氫效能的影響，實(shí)驗時，對培養(yǎng)基中的K2HPO4濃度從0 mg/L逐步添加到3 mg/L；第二部分研究了由K2HPO4與K2HPO4以1:1比例混合作為緩沖溶液對Biohydrogenbacterium R3sp.nov.發(fā)酵產(chǎn)氫效能的影響，PBS的濃度由0.01 mol/L逐步添加至0.3 mol/L。

1.3 測量及分析方法

以O(shè)D600nm表示細(xì)胞生長量；pH值的測量采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法[11]；葡萄糖濃度用葡萄糖試劑盒法進(jìn)行測量；產(chǎn)氣量由LM-1型濕式氣體流量計測量。

液相末端發(fā)酵產(chǎn)物采用GC-122型氣相色譜儀、氫火焰檢測器；采用上海分析儀器廠生產(chǎn)的GC-122型氣相色譜儀，不銹鋼柱，柱長2 m(內(nèi)徑5 mm)，擔(dān)體GDX103，60～80目，氫火焰檢測器，汽化室200℃，柱溫190℃，檢測室溫度240℃，載氣氮?dú)猓魉?0 ml/min,氫氣流速50 ml/min，空氣流速500 ml/min。測量時取1 ml被測樣品，加入濃度為6 mol/L的HCl 1～2滴，在5000 rpm/min下離心15 min，取上清液2 μl進(jìn)樣檢測。氫氣、氮?dú)夂涂諝鈦碓捶謩e來自氫氣發(fā)生器、氮?dú)獍l(fā)生器和空氣發(fā)生器。

發(fā)酵氣體的組分采用上海分析儀器廠生產(chǎn)的SC-II型氣相色譜儀進(jìn)行測量，安裝熱導(dǎo)池檢測器，不銹鋼柱，柱長與直徑2 m×φ5，載體TDX，60-80目，載氣氮?dú)猓魉?0 ml/min,柱溫和檢測室溫度150℃，進(jìn)樣量0.5 ml。

2 結(jié)果與討論

2.1 K2HPO4對Biohydrogenbacterium R3 sp. nov.發(fā)酵及生長效能的影響

2.1.1 K2HPO4對 Biohydrogenbacterium R3 sp. nov.產(chǎn)氫的影響

眾所周知磷是輔酶Ⅰ、輔酶Ⅱ、輔酶A、輔羧化酶、各種磷酸腺苷等的組分，同時在底物水平磷酸化過程中起著與甘油醛-3-磷酸結(jié)合產(chǎn)生1，3-二磷酸甘油酸，隨后用于ATP合成的關(guān)鍵性作用。因此在菌種的培養(yǎng)過程中適量的添加磷酸鹽，能夠顯著的提高菌種生長及產(chǎn)氫的能力。

如圖3所示，培養(yǎng)基中未添加K2HPO4時的生物氣體和氫氣產(chǎn)量分別為2736.5 ml/L和996 ml/L，比產(chǎn)氫率為1.13 mol H2/mol葡萄糖，然而當(dāng)培養(yǎng)基中添加了0.5 g/LK2HPO4時，BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的比產(chǎn)氫率立即開始上升至1.86 mol H2/mol葡萄糖；生物氣體產(chǎn)量、氫氣產(chǎn)量以及比產(chǎn)氫率都隨著培養(yǎng)基中K2HPO4濃度的繼續(xù)升高而升高，并且在K2HPO4的濃度達(dá)到1.5 g/L時達(dá)到最大值，分別為4960 ml/L和2107.5 ml/L，氫氣含量為42.49%，此時的比產(chǎn)氫率也達(dá)到了最大值1.93 mol H2/mol葡萄糖；然而，當(dāng)K2HPO4濃度達(dá)到2.0 g/L時，生物氣體和氫氣產(chǎn)量急劇減少至3652 ml/L和2036 ml/L，比產(chǎn)氫率也下降至1.2 mol H2/mol葡萄糖；當(dāng)K2HPO4在3.0 g/L時，生物氣體和氫氣的產(chǎn)量僅為零。磷酸鹽的過量添加不僅對菌種的生長及產(chǎn)氫起不到促進(jìn)作用，反而干擾了正常的底物水平磷酸化的過程，ATP不能正常的產(chǎn)生，導(dǎo)致菌種缺少能量來源，從而其生長及產(chǎn)氫作用被抑制，甚至使菌種進(jìn)入衰亡期或直接死亡。

圖3 K2HPO4對BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.產(chǎn)氫效能的影響Fig.3 Effects of K2HPO4on hydrogen production of BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.

2.1.2 K2HPO4對Biohydrogenbacterium R3 sp.nov.生長的影響

如圖4所示為K2HPO4對Biohydrogenbacterium R3sp.nov.的OD600nm和葡萄糖利用率的影響。OD600nm隨著K2HPO4的添加呈現(xiàn)劇烈的變化，在K2HPO4濃度為0.5 g/L時出現(xiàn)了一次劇烈的下降，這是因為一部分的BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.不適應(yīng)額外的磷酸鹽濃度的突然增加而出現(xiàn)了菌種死亡的情況，存活下來的BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.菌種依然保持著高效產(chǎn)氫的活性。當(dāng)培養(yǎng)基中的K2HPO4濃度達(dá)到1.0 g/L～2.5 g/L時，OD600nm維持在1.35 g/L～1.6 g/L之間，而 K2HPO4濃度為 3 g/L時的OD600nm由于高濃度磷酸鹽抑制現(xiàn)象又下降至0.2 g/L。

BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.對葡萄糖的利用率一直保持在95%左右，并沒有因為K2HPO4的添加而受到過多的波動，這表明BiohydrogenbacteriumR3 sp.nov.能夠幾乎完全利用葡萄糖底物作為自身生長、發(fā)育及產(chǎn)氫的營養(yǎng)物質(zhì)。值得注意的是，當(dāng)K2HPO4濃度為3 g/L時，細(xì)胞生長以及產(chǎn)氫能力都急速下降，然而BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.對葡萄糖的利用率僅下降至90.82%。這是因為在高濃度的磷酸鹽條件下，反應(yīng)初期的BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.能夠利用葡萄糖進(jìn)行生長，但當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖剩余不多時候，在高濃度磷酸鹽以及缺乏碳素營養(yǎng)的作用下，BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.開始死亡，所以當(dāng)試驗結(jié)束的時候會發(fā)現(xiàn)當(dāng) K2HPO4濃度為 3g/L時，BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的產(chǎn)氫能力幾乎為零，OD600nm也低至0.2g/L，但是葡萄糖消耗率依然維持在90%左右。

圖4 K2HPO4對BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.葡萄糖利用率和氫氣含量的影響Fig.4 Effects of K2HPO4on glucose consumption ration and H2 content ofBiohydrogenbacteriumR3sp.nov.

2.1.3 K2HPO4對BiohydrogenbacteriumR3 sp.nov.液相末端產(chǎn)物的影響

K2HPO4對BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.液相末端產(chǎn)物以及發(fā)酵終pH值的影響見圖5。BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.為乙醇型發(fā)酵細(xì)菌，乙醇和乙酸為主要液相末端發(fā)酵產(chǎn)物，因此反應(yīng)結(jié)束的終pH值保持在3.5～5范圍內(nèi)。當(dāng) K2HPO4在濃度為1. 0～2.5 g/L范圍內(nèi)時，乙醇和乙酸的產(chǎn)量相對較高，當(dāng)K2HPO4濃度為1.5 g/L時，乙醇和乙酸的濃度最高，分別是5613.58 mg/L和2884.84 mg/L；隨 K2HPO4濃度的繼續(xù)升高，乙醇和乙酸的產(chǎn)量急劇下降。液相末端產(chǎn)物中始終以乙醇和乙酸為主，K2HPO4濃度的變化沒有改變菌株BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.發(fā)酵產(chǎn)氫的代謝類型，代謝類型仍屬乙醇型發(fā)酵。當(dāng)K2HPO4濃度為0 g/L～2 g/L范圍內(nèi)的終pH值始終保持在3.0～3.5之間，但當(dāng)K2HPO4濃度超過2.5 g/L時，培養(yǎng)基內(nèi)的終pH值急劇上升至3.94，然而即使在K2HPO4濃度為3 g/L，BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的產(chǎn)氫量降至0時，培養(yǎng)基的終pH值也僅為4.83，這說明K2HPO4的存在不僅對BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的生長產(chǎn)氫具有良好的促進(jìn)作用，同時對于培養(yǎng)基內(nèi)的環(huán)境pH值也具有良好的緩沖作用，提高了培養(yǎng)基系統(tǒng)的抗酸堿沖擊性，為BiohydrogenbacteriumR3sp. nov.的生長提供了pH值適宜的酸堿環(huán)境。

圖5 K2HPO4對BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.液相末端產(chǎn)物的影響Fig.5 Effects of K2HPO4on the end liquid products of BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.

2.2 PBS對Biohydrogenbacterium R3 sp.nov.產(chǎn)氫發(fā)酵效能的影響

2.2.1 PBS對Biohydrogenbacterium R3 sp.nov.產(chǎn)氫發(fā)酵的影響

由于磷元素通常以1價或2價的磷酸根離子(H2PO4-和HPO42-)的形式參與糖代謝等重要過程，與其他有機(jī)物結(jié)合形成磷脂、核酸、輔酶和ATP等，因此本實(shí)驗用KH2PO4和KH2PO4以1:1比例混合制成PBS添加到培養(yǎng)基中，研究其對BiohydrogenbacteriumR3 sp.nov.的產(chǎn)氫與發(fā)酵效能的影響。

圖6所示磷酸鹽的濃度對Biohydrogenbacterium R3sp.nov.產(chǎn)氫效能具有較明顯的影響。當(dāng)培養(yǎng)基中添加了0.01mol PBS之后，BiohydrogenbacteriumR3sp. nov.的產(chǎn)氣量及產(chǎn)氫量分別為2960 ml和1256 ml，平均產(chǎn)氫速率也達(dá)到了2.3632 mmol H2/g cell·h，并且BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的產(chǎn)氫量及平均產(chǎn)氫速率都隨著PBS的濃度持續(xù)增加而呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)PBS濃度達(dá)到0.15 mol時，Biohydrogenbacterium R3sp.nov.的生物氣體、氫氣產(chǎn)量和平均產(chǎn)氫速率分別達(dá)到最大值 3860 ml/L、1832.7 mlH2/L和 2.6324 mmol H2/g·cell·h，但是當(dāng)PBS的濃度繼續(xù)上升時，BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的產(chǎn)氣量及產(chǎn)氫量急劇下降，當(dāng)PBS濃度為0.2 mol時，Biohydrogenbacterium R3sp.nov.的產(chǎn)氣量及產(chǎn)氫量則分別下降為1500 ml和 342.1mlH2/L，而 PBS濃度達(dá)到 0.25 mol時，BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.幾乎不能夠產(chǎn)生氫氣，產(chǎn)氫量下降至0。磷元素積極參與到BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的發(fā)酵代謝循環(huán)中，濃度適中的磷酸鹽對BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的發(fā)酵及產(chǎn)氫效率具有十分明顯的促進(jìn)作用，BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的產(chǎn)氫代謝十分旺盛。

圖6 PBS對BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.產(chǎn)氫性能的影響Fig.6 Effects of PBS on hydrogen production of BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.

PBS對BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的葡萄糖利用率以及細(xì)胞生長的影響如圖7所示，可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中添加了PBS之后，BiohydrogenbacteriumR3 sp.nov.的葡萄糖利用率呈現(xiàn)出來劇烈的波動，當(dāng)磷酸鹽緩沖液濃度為0.05 mol時，葡萄糖的利用率最高為98.5%；而當(dāng)磷酸鹽緩沖液濃度高于0.05 mol時，葡萄糖利用率逐漸下降；當(dāng)磷酸鹽緩沖液濃度為0.20 mol時，葡萄糖利用率降到最低值58.2%。當(dāng)PBS濃度繼續(xù)增加時，BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的葡萄糖利用率又繼續(xù)上升，當(dāng)PBS濃度上升至0.3 mol時，葡萄糖濃度則又上升至66.7%，這與氫氣產(chǎn)量的變化趨勢正好相反。

圖7 磷酸鹽緩沖液對BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.葡萄糖利用率和OD600nm的影響Fig.7 Effects of PBS on glucose consumption ration and H2content of BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.

當(dāng)培養(yǎng)基中添加了 PBS之后的BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.并沒有出現(xiàn)生長速度迅速增加的情況，其變化趨勢與葡萄糖利用率的變化趨勢比較類似，OD600nm在PBS濃度為0.05 mol和0. 25 mol時達(dá)到最大值與最小值分別為0.5058 g/L和0.02702 g/L。

2.2.2 PBS對Biohydrogenbacterium R3 sp.nov.液相末端發(fā)酵產(chǎn)物的影響

如圖8所示，PBS對液相末端產(chǎn)物的影響特征與其對產(chǎn)氫量的影響特征相似。當(dāng)PBS濃度為0.15 mol時，乙醇和乙酸產(chǎn)量最大，分別為6987.58 mg/L和6148.08 mg/L，此時的產(chǎn)氫量也最高(氫氣產(chǎn)量為1832.7 mlH2/L)，說明氫氣的產(chǎn)生與乙醇相伴而生，間接的證明了乙醇型發(fā)酵細(xì)菌代謝類型的存在。當(dāng)PBS濃度繼續(xù)上升時，乙醇和乙酸的產(chǎn)量迅速降低，當(dāng)PBS濃度上升至0.3 mol時，乙醇和乙酸濃度分別降低至 0 mg·L-1和 461.87 mg·L-1，此時，由于BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的生長及產(chǎn)氫代謝都十分微弱，而添加了0.3 mol后PBS后的培養(yǎng)基初始pH值為6.0，經(jīng)過發(fā)酵之后的終pH值卻上升為6.43，這是因為濃度過高的PBS中，由于磷元素過多，打亂了BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.生化反應(yīng)過程的正常運(yùn)行，PBS不僅不能對BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.起到酸堿調(diào)節(jié)保持其適宜的pH值生長環(huán)境，反而使得菌種BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.大量死亡，反應(yīng)體系的發(fā)酵作用幾乎停止。

圖8 磷酸鹽緩沖液對菌株BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.液相末端產(chǎn)物的影響Fig.8 Effects of phosphate buffer on end liquid products of BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.

3 結(jié)論

（1）K2HPO4對BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的生長及產(chǎn)氫效能都具有良好的促進(jìn)作用，且培養(yǎng)基中的pH值具有良好的維持作用，當(dāng)K2HPO4濃度為1.5 g/L時，BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的生物氣體產(chǎn)量、氫氣產(chǎn)量以及產(chǎn)氫率都達(dá)到最大，分別為4960 ml/L， 2107.5 ml/L和1.93 mol H2/mol葡萄糖，培養(yǎng)基內(nèi)的pH值始終維持在3.0～5.0之內(nèi)，此pH值被認(rèn)為是乙醇型發(fā)酵產(chǎn)氫菌種的適宜pH值。

（2）PBS對BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的生長及產(chǎn)氫效能以及緩沖培養(yǎng)基終pH值同樣也具有較良好的促進(jìn)作用，當(dāng)PBS濃度達(dá)到0.15 mol時，BiohydrogenbacteriumR3sp.nov.的生物氣體，氫氣產(chǎn)量和平均產(chǎn)氫速率分別達(dá)到最大值3860 ml/L，1832.7 mlH2/L和2.6324 mmol H2/g·cell·h。

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