兩種蛤仔線粒體16S rRNA基因和COⅠ基因的序列比較

劉相全,包振民,方建光,王如才

(1.山東省海洋水產研究所,山東 煙臺 264006; 2.中國海洋大學,山東 青島 266003; 3.中國水產科學研究院 黃海水產研究所,山東 青島 266071)

線粒體DNA(mtDNA) 由于具有分子質量小、結構簡單、表現為母系遺傳、進化速度快等特點,成為動物群體遺傳學和系統進化研究中的重要對象。對于選定的基因或基因片段,可通過互補于高度保守區域的通用引物進行 PCR 擴增,然后進行分子克隆測序或 PCR產物直接測序,對序列數據進行分析。在海洋貝類方面,根據mtDNA區段或基因的序列來構建分子系統樹,并進而進行分類和進化分析的研究已有許多報道。

Canapa等[1-3]根據16S rRNA基因序列分別對8種、14種簾蛤科貝類進行聚類分析表明,綴錦蛤亞科的 6個種類盡管可以聚在一起,但在屬的水平上的分類則不能很好的對應; 對 8種扇貝科貝類的系統發生進行了研究,發現有兩種扇貝應為同一種類。Barucca等[4]分析了 23種扇貝科貝類的 16S和 12S基因片段,兩個片段反應的扇貝間的親緣關系基本一致。Matsumoto等[5-6]根據 COⅠ的氨基酸序列對17種扇貝科貝類的分類進行了研究,結果支持Waller的形態學分類系統; 對翼形亞綱的分類進行了研究,并與18S rDNA的分類結果進行了比較。Yu等[7]根據16S和COⅠ兩個片段的序列分析了中國沿海 4種牡蠣的分類情況。楊建敏等[8]研究了 3 種鮑的 16S rRNA 基因。Therriault等[9]根據 16S和COⅠ兩個片段的序列對黑海飾貝科的分類進行了研究,分清了同物異名的兩個種; 16S和 COⅠ兩個片段對種內生態型之間的差異則不能很好地區分。

蛤仔屬(Ruditapes)作為簾蛤科的一個屬,是Fischer-Piette等對綴錦蛤亞科訂正后提出的。在我國蛤仔屬只有兩個種,即菲律賓蛤仔(R.philippinarum)和雜色蛤仔(R.variegata)。為了進一步比較這兩種在外形上酷似的簾蛤科貝類,本文通過對線粒體 DNA的16S和COⅠ兩個片段進行擴增、測序,分析了兩個序列的基本特征,并引用Genbank中其他2種貝類的序列,進行了系統發生的比較。

1 材料與方法

1.1 樣品收集和DNA提取

菲律賓蛤仔(R.philippinarum,簡稱 RP)取自青島,雜色蛤(R.variegata,簡稱RV)取自湛江硇洲島。常規酚氯仿法提取基因組DNA。

1.2 PCR擴增、克隆和測序

PCR擴增用引物：16S采用Palumbi等[10]設計的通用引物,16sar-L (5′-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3′)和 16sbr-H (5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′); COⅠ采用 Folmer 等[11]設計的引物COIL1490/COIH2198：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG/TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。PCR擴增采用 25μL體系,包括 30～50 ng基因組DNA,0.2 mmol/L dNTP,1 μmol/L 引物,緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl,1.5 mmol/LMgCl2,50 mmol/L KCl),以及 0.025 UTaq酶/μL。94℃變性2 min,然后35個循環(94 ℃ 40 s,56℃1min,72℃1min)最后72℃延伸5 min。擴增片段在2%的瓊脂糖膠上檢測。PCR產物連接到PMD18-T,然后轉化到E.coliDH5α細胞,37℃培養,涂平板,挑克隆,載體引物檢測,雙向測序。序列提交到Genbank。

1.3 序列分析

測序結果去掉兩端引物序列后,用CLUSTALX 1軟件進行比對,用MEGA 2軟件(Kumar等,2001)的距離法對序列進行分析。根據Kimura(1980)雙參數法計算距離,產生的矩陣根據 NJ法(Saitou and Nei,1987)分析系統發生的關系。系統發生關系的置信度用自展(bootstrap)重復分析驗證(重復次數 NJ為 1 000,MP為 100)。引用的序列包括硬殼蛤(Mercenaria mercenaria,簡稱 MM。16S：AJ548773,COⅠ：U47648)和白斑烏賊(Sepia latimanus,簡稱Sla。16S：AB192322,COⅠ：AB192338)以及菲律賓蛤仔16S的序列AF484296。菲律賓蛤仔COⅠ和雜色蛤仔 COⅠ、16S的序列號為 JN248565～JN248567。

2 結果

每種蛤仔用10只個體進行PCR擴增,所有擴增結果均為單一產物。兩種蛤仔的序列長度和 4種堿基的含量見表1、表2。菲律賓蛤仔和雜色蛤仔16S序列長度分別為511 bp和476 bp,COⅠ序列的長度都是 658 bp,結合對軟體動物相關片段的分析,這兩個片段具有明顯的長度保守性。兩個片段的GC含量菲律賓蛤仔都低于雜色蛤仔,而 GC含量都低于AT含量,符合線粒體DNA的堿基組成特點。兩個片段的GC含量比較接近,但COⅠ基因片段堿基T的含量要明顯高于16S rRNA基因片段核苷酸中T堿基的含量。

表1 兩種蛤仔16S序列的長度以及堿基組成Tab.1 Size and GC content of the 16S rRNA gene

表2 兩種蛤仔COⅠ序列的長度以及堿基組成Tab.2 Size and GC content of the COⅠgene

兩種蛤仔 COⅠ基因片段 658個核苷酸編碼的20種氨基酸組成的219個氨基酸序列中,都是亮氨酸(Leu)含量最高,分別為 16.44%(RP)和14.16%(RV)。排在其后的氨基酸含量兩種蛤仔略有不同,菲律賓蛤仔依次是甘氨酸(Gly),甲硫氨酸(Met),而雜色蛤仔為甲硫氨酸(Met),甘氨酸(Gly)。從總體看,兩種蛤仔的氨基酸組成還是具有較高的相似性(表 3)。

表3 兩種蛤仔COⅠ基因的氨基酸組成Tab.3 The amino acid composition(%) of the COⅠgene

兩種蛤仔16S序列比對結果見圖1。516個位點中共有 117個變異位點(其中,插入缺失 44,多態位點73個),COⅠ序列658個位點中共有160個變異位點,全是多態位點,沒有插入缺失(圖2)。COⅠ基因編碼的219個氨基酸序列,兩種蛤仔有29個氨基酸不同(圖 3)。

圖1 兩種蛤仔16S序列的比對圖Fig.1 Alignment of 16S rDNA sequences of two clams

以 16S序列計算兩種蛤仔與其他幾種貝類的堿基替換/顛換率以及距離,以 COⅠ基因編碼的氨基酸序列計算兩兩之間的遺傳距離,結果見表4。兩兩之間的遺傳距離最小值 16S的結果在菲律賓蛤仔與雜色蛤仔之間為0.17,而COⅠ氨基酸序列的結果在雜色蛤仔與硬殼蛤之間為 0.14,不過與兩種蛤仔之間的遺傳距離0.15非常接近。

系統關系分析分別用16S序列和COⅠ編碼的蛋白序列進行。根據16S序列構建的系統樹見圖4,NJ樹和MP樹完全一致,兩種蛤仔都聚為一支,硬殼蛤與白斑烏賊單獨聚為一支,這與傳統的分類是一致的。而根據COⅠ基因編碼的蛋白序列構建的系統樹(圖5),與16S序列的結果不太一致,NJ樹雖將兩種蛤仔聚在一起,但這一支的置信度比較低,也就是說,兩種蛤仔與硬殼蛤的差異不是很大; 而MP樹則將兩種蛤仔與硬殼蛤聚為一支,說明這三種蛤之間的差異非常小。

圖2 兩種蛤仔COⅠ序列的比對圖Fig.2 Alignment of COⅠgene sequences of two clams

圖3 兩種蛤仔COⅠ蛋白序列的比對圖Fig.3 Alignment of the amino acid sequences of COⅠgene of two clams

表4 4種貝類兩兩之間的遺傳距離(分別對16S和COⅠ編碼的氨基酸序列)Tab.4 The pair-wise genetic distance matrix of COⅠand 16S rRNA gene

圖4 根據16S序列構建的系統樹Fig.4 Phylogenetic relationships based on 16S rRNA sequences

圖5 根據COⅠ基因編碼的蛋白序列構建的系統樹Fig.5 Phylogenetic relationships based on the amino acid sequences of COⅠgenes

3 討論

簾蛤科貝類在全世界廣為分布,包括 500多個種類,許多種類都具有重要經濟價值。簾蛤科貝類生活習性比較一致,形態也比較相似,這使得根據形態對系統發生關系的分析非常困難。因此,許多的生化手段被用來研究簾蛤科的分類問題,而分子生物學的研究還剛剛開始。本文得到了兩種蛤仔線粒體DNA 16S rRNA和COⅠ兩個片段的序列,分析了兩種蛤仔這兩個片段的序列特征,并從進化的角度分析了它們的變異,為利用分子生物學的方法研究簾蛤科的分類提供了一定的依據。

蛤仔屬在簾蛤科中的分類地位一直存在著爭議,其屬下種的歸屬問題也曾經比較混亂。因為蛤仔屬Ruditapes和綴錦蛤屬Tapes、石蛤屬Venerupis的親緣關系很近,形態結構非常相似。1951年,Keen把Ruditapes作為Tapes的亞屬。1971年,法國自然史博物館Fischer-Piette和Metivier對綴錦蛤亞科各個屬鉸合部主齒板的形態進行了仔細比較研究后,把Ruditapes提升為屬,根據他們的分類系統,菲律賓蛤仔與雜色蛤仔都應當是在Ruditapes的屬下[12]。

本文對 16S序列的分析結果表明,兩種蛤仔的親緣關系比較接近,而與同為簾蛤科的硬殼蛤有明顯的差異。但對COⅠ序列的分析結果則表明,兩種蛤仔之間的關系以及它們與硬殼蛤之間的關系差異不明顯。不同的DNA片段進行聚類分析會產生不同的結果[13],這說明蛤仔屬與其他相近屬種的親緣關系非常接近。潘鶴婷等[14]的聚類結果也表明兩種蛤仔不能聚為一支。Canapa等[3]對簾蛤科貝類根據 16S rRNA 基因序列的研究表明,綴錦蛤亞科的6個種類盡管可以聚在一起,但在屬的水平上的分類則不能很好的對應,其中的菲律賓蛤仔與錯紋蛤仔(Ruditapes decussatus)就不能在屬的水平上聚類。一般認為,COⅠ序列比 16S序列具有更大的變異性,因此,在區分近緣種的分類關系上,COⅠ序列比16S序列更靈敏。Boudry等[15]用9種內切酶對太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)和葡萄牙牡蠣(Crassostrea angulata)的253個個體的16S序列PCR產物進行酶切,未發現有任何酶切位點變異; 但用4種內切酶對同樣個體的COⅠ序列PCR產物進行酶切,卻檢測到了明顯的多態性。

對簾蛤科綴錦蛤亞科各個屬及屬內包含的種進行細致明確的分類,需要對更多相近種分析更多的DNA序列,包括核DNA和線粒體DNA的序列。在系統演化研究中,采用多組分子生物學數據并結合形態特征、解剖結構等分析,將有助于正確闡述物種間真實的進化關系以及某個物種在系統演化中的確切地位。

[1]Canapa A,Barucca M,Marinelli A,et al.Molecular data from the 16S rRNA gene for the phylogeny of Pectinidae (Mollusca：Bivalvia) [J].J Mol Evol,2000,50：93-97.

[2]Canapa A,Marota I,Rollo F,et al.Phylogenetic analysis of Veneridae (Bivalvia)：Comparison of molecular and palaeontological data[J].J Mol Evol,1996,43：517-522.

[3]Canapa A,Schiaparelli S,Marota,et al.Molecular data from the 16S rRNA gene for the phylogeny of Veneridae (Mollusca：Bivalvia) [J].Marine Biology,2003,142：1125-1130.

[4]Barucca M,Olmo E,Schiaparelli S,et al.Molecular phylogeny of the family Pectinidae (Mollusca：Bivalvia)based on mitochondrial 16S and 12S rRNA genes[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2004,31：89-95.

[5]Matsumoto M.Phylogenetic analysis of the subclass Pteriomorphia (Bivalvia) from mtDNA COI sequences[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2003,27：429-440.

[6]Matsumoto M,Hayami I.Phylogenetic analysis of the family Pectinidae (Bivalvia) based on mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I[J].J Moll Stud,2000,66：477-488.

[7]Yu Z N,Kong X Y,Zhang L S,et al.Taxonomic status of four Crassostrea oysters from China as inferred from mitochondrial DNA sequences[J].Journal of Shellfish Research,2003,22(1)：31-38.

[8]楊建敏,鄭小東,王如才,等.3種鮑16S rRNA 基因片段序列的初步研究[J].青島海洋大學學報,2003,33(1)：36-40.

[9]Therriault T W,Docker M F,Orlova M I,et al.Molecular resolution of the family Dreissenidae (Mollusca：Bivalvia) with emphasis on Ponto-Caspian species,including first report ofMytilopsis leucophaeatain the Black Sea basin[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2004,30(3)：479-489.

[10]Palumbi S R,Martin A,Romano S,et al.The simple fool’s guide to PCR[J].Honolulu：University of Hawaii Press,1991.

[11]Folmer O,Black M,Hoeh W,et al.DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates[J].Mol Mar Biol Biotechnol,1994,3：294-299.

[12]莊啟謙.中國動物志：軟體動物門 雙殼綱 簾蛤科[M].北京：科學出版社,2001：41-52.

[13]劉相全,包振民,胡景杰,等.幾種簾形目貝類 rDNA ITS序列的比較[J].高技術通訊,2007,17(4)：435-440.

[14]潘鶴婷,袁媛,吳琪,等.綴錦蛤亞科(Tapetinae)貝類線粒體 DNA序列的系統學分析[J].海洋與湖沼,2008,39(3)：284-290.

[15]Boudry P S,Heurtebise S,Collet B,et al.Differentiation between population of the Portuguese oyster,Crassostrea angulata(Lamark)and the Pacific oyster,Crassostrea gigas(Thunberg),revealed by mtDNA RFLP analysis[J].J Exp Mar Biol Eco,1998,226：279-291.