NF-κB在細胞凋亡中的調節作用和應用前景

張 勇 崔 巖

(沈陽農業大學畜牧獸醫學院,沈陽 110866)

近些年來,隨著生活水平的日益提高,消費者對畜產品的品質要求也越來越高,肉品質的提高毫無疑問成為當下討論的熱點之一,而嫩度則是衡量肉品質的一項重要指標。宰后肌肉嫩化是改善肌肉嫩度的重要途徑之一,肌肉嫩化的發生普遍認為是肌細胞的細胞骨架降解造成的[1]。而目前對于細胞骨架降解的機理研究大部分集中在鈣激活酶系統、組織蛋白酶系統和蛋白酶體上,有關于細胞凋亡在肌肉嫩化中的作用國內外還鮮見報道。據證實,核轉錄因子 -κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)與細胞凋亡存在密切關系,并參與多種凋亡相關基因的轉錄調控[2]。

1 NF-κB概述

1.1 NF-κB的組成

NF-κB最早是于 1986年由 Sen和 Baltimore發現,他們應用凝膠電泳遷移率方法在 B淋巴細胞核提取物中檢測到一種能與免疫球蛋白 κ輕鏈基因的增強子 κB序列(GGG ACT TTCC)特異結合的核蛋白因子,并命名為 NF-κB。 NF-κB是細胞核內重要的轉錄調節因子,是細胞存活、細胞周期、細胞黏附和遷移的重要調節者[3]。

NF-κB是由 NF-κB/Rel蛋白家族成員 NF-κB1(p50,前體為 p105)、NF-κB2(p52,前體為 p100)、RelA(p65)、RelB和 C-Rel以同源或異源二聚體形式組成的。所有 NF-κB/Rel蛋白的 N端均有 1段由大約 300個氨基酸組成的 Rel同源結構域(Rel homology dom ain,RHD),該結構域包括二聚體化結構域,IκB結合位點,核定位信號和 DNA結合部位(NLS)。p65、RelB和 c-Rel的 C端含有轉錄激活域(transactivation domain),其中富含絲氨酸、酸性氨基酸和疏水性氨基酸,能直接作用于轉錄元件而激活轉錄過程,而 p50和 p52則無此結構[4]。p50/p65發現最早,分布和作用最廣泛,是我們通常所說的 NF-κB,存在于細胞漿中[5-6]。目前已知存在于細胞質中的 Rel/NF-κB蛋白復合物有 2種類型,即 Rel/NF-κB二聚體與 IκB家族結合所形成的三聚體以及 Rel蛋白與未裂解前體(如 p100)結合所形成的二聚體[7]。

1.2 NF-κB的激活

NF-κB的內源性抑制因子主要是 IκB抑制蛋白家族 ,主要包括 IκBα、IκBβ、IκBε、IκBγ、Bcl3、p105和 p100。在細胞靜息狀態下,NF-κB與其抑制蛋白 IκB結合,組成異源多聚體(p50-p65-IκBα或 p50-p65-IκBβ),阻止 NF-κB進入細胞核 ,以非活性復合物的形式存在于細胞質中。不同的 IκB抑制 NF-κB的能力不同,它們與 NF-κB二聚體上的 RHD發生作用,掩蓋 NF-κB的 NLS,使之停留在胞質而抑制 NF-κB核易位[8]。但是處于靜息狀態的成熟 B淋巴細胞等極少數細胞例外,它們的胞漿中存在活化的 NF-κB。NF-κB是一類具有和某些基因上啟動子區固定核苷酸序列結合而啟動基因轉錄的功能性蛋白質,所以諸多因素可以使NF-κB促進基因轉錄活性增強[9]。

NF-κB的激活機制是一個較為復雜的過程,目前公認的主要有 2條途徑：經典途徑和旁路途徑[10-11]。當細胞受到蛋白激酶 C、細胞因子、鈣離子載體等細胞外信號刺激時,IκB激酶(IκB kinase,IKK)的亞單位 IKKβ由于磷酸化而激活,進而作用于 NF-κB二聚體(p50/p65)與 IκB結合的復合物,引起 IκBα被磷酸化,IκBα磷酸化進一步被泛素結合酶快速泛素化,然后在蛋白水解酶復合體作用下發生降解,從而將 NF-κB二聚體從三聚體(p50-p65-IκB)中釋放出來進行核易位,與基因上的 κB位點發生特異性結合,進而轉入細胞核內發揮作用[12],這個過程即為經典途徑。與經典途徑不同的是,旁路途徑主要指 NF-κB中所含有的 p100或者 p105的二聚體被激活。在特定的細胞類型中,當細胞受到外界信號刺激后,在 NF-κB誘導激酶(NIK)的作用下使 IKKα和前體 p100磷酸化,經蛋白激酶作用誘導 NF-κB/p100產生 p52-RelB異源二聚體,并使其進入細胞核與靶基因結合參與一系列的核轉錄活動[13]。

除此之外,近年的研究發現,紫外線激活 NF-κB的機制與以上途徑均不相同。紫外線通過激活酪蛋白激酶 2(CK 2)引起 IκBα的 C端磷酸化,從而引起 IκBα泛素化后降解。CK 2的激活不依賴 IKK而是通過 p38絲裂原活化蛋白激酶,因此 p38-CK 2-IκBα也是激 活 NF-κB的 途徑之一[14]。

2 NF-κB與細胞凋亡

細胞凋亡(apoptosis)是指機體在一定生理、病理條件下為維持內環境穩定,一個細胞接受其內在指令而自動結束生命的過程。這個現象最早由Carl Vogt發現的,并將其命名為細胞凋亡[15]。其形態學改變包括細胞皺縮、染色質濃縮、核裂解成碎片等。研究表明,活化后的 NF-κB與細胞凋亡有密切關系,其參與多種凋亡相關基因的轉錄調控,具有抑制細胞凋亡和促進細胞凋亡的雙向作用[2]。

2.1 NF-κB對細胞凋亡的抑制作用

NF-κB具有抑制細胞凋亡的作用最早是在1995年被證實的,試驗中發現被剔除 RelA基因的胎鼠發育到 15～16 d時死亡,并伴隨著肝細胞的大量凋亡,其機制是通過腫瘤壞死因子受體 1(tumor necrosis factor receptor1,TNFR1)介導發揮作用[16]。NF-κB對細胞凋亡的抑制過程是一個涉及多個信號通路的復雜過程,其主要是通過對下游抗凋亡基因的轉錄激活作用來實現的,這些基因包括 IEX-IL、Bcl-2家族、c-FLIP以及 IAP(inhibitor of apoptosis)家族的 XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2等,其調節位點上均有 NF-κB的結合位點[17],它們的產物通過作用于細胞凋亡酶 -3(caspase-3)和線粒體的上游而發揮作用。例如,在纖維肉瘤細胞中 ,NF-κB誘導 c-IAP-1、c-IAP-2、TNFR1和TNFR2共同表達,抑制細胞凋亡酶 -8(caspase-8)活性,阻斷細胞色素 C釋放,從而抑制細胞凋亡。眾所周知,細胞色素 C是 caspase-3激活的促發因素,是調控的關鍵環節。又如 B淋巴細胞中,CD40誘導的抗凋亡也需要 NF-κB參與,通過上調 Bcl-2、Bcl-X表達而發揮作用,如果阻斷 NF-κB的激活就會消除上調作用而無法起到抗凋亡作用。

隨著研究的深入,人們發現 NF-κB的抗細胞凋亡作用與越來越多的信號途徑有關。A 20是一種鋅指蛋白,研究表明,NF-κB可以通過調控 A 20蛋白的表達影響由 TNF誘導的細胞凋亡過程[18]。Gadd45β是一種核蛋白,研究發現,NF-κB是其上游的調節因子,可以通過調節其表達來影響激酶(JNK),進而抑制細胞凋亡的過程[19]。

2.2 NF-κB對細胞凋亡的促進作用

在對 NF-κB的抗細胞凋亡作用的研究同時,一些證據則顯示在不同的刺激因素和特定的細胞類型中,NF-κB對細胞凋亡具有促進作用。Baichwal等[20]報道,人的胚胎腎細胞系 293在血清撤除時隨著 NF-κB的活化而發生細胞凋亡,NF-κB的負顯性突變基因已具有同樣的結果。Dumont等[21]報道,抑制 NF-κB的活性可以使 T細胞免于由過氧化氫誘導的細胞凋亡。Ivanov等[22]發現,在紫外線誘導黑色素瘤細胞凋亡的過程中 NF-κB的表達下調,細胞凋亡也隨之減少。Campbell等[23]則發現,NF-κB是通過抑制抗凋亡基因而促進細胞發生凋亡。Chen等[24]在腫瘤壞死因子相關凋亡途徑的研究中發現,當 RelA過量表達時,呈現對細胞凋亡的抑制作用,當 c-Rel表達增加時,則呈現對細胞凋亡的促進作用。由此可見,NF-κB在細胞凋亡中的雙向作用不僅取決于不同的刺激因素和細胞類型,也與激活的 NF-κB成員的種類和數量有關。

3 細胞凋亡與宰后肌肉嫩化

動物被屠宰放血后,肌細胞便失去營養基質的供給,血液循環的終止導致肌細胞沒有氧氣運輸的途徑。缺血使細胞酸中毒,缺氧使線粒體內三羧酸循環受抑制,心肌轉向糖酵解以尋求能量的補充,糖酵解產生大量乳酸堆積在心肌中引起細胞內 H+濃度增高,從而使 Na+/H+交換增強,H+流出胞外而 Na+流入胞內,造成細胞內 H+濃度下降,pH升高,Na+超載,繼而引起 Na+/Ca2+交換增加,并引起 Ca2+超載。在這種非常有害的生理條件下,細胞內產生了凋亡信號,很有可能誘發肌細胞強制性死亡。正如 Ouali等[25]推斷,動物宰后應該有一個細胞凋亡的過程,如圖 1所示。

圖 1 宰后肌肉轉化為肉的過程Fig.1 The process ofmuscle transformed tomeat after slaughter

宰后肌肉的成熟嫩化對嫩度的改善主要歸因于對肌肉結構蛋白的有限降解。而大量試驗已經證明,在細胞凋亡過程中,一些細胞凋亡酶參與細胞骨架和結構蛋白的降解。如 Communal等[26]研究證實了 caspase-3在體外條件下參與心肌多種骨架蛋白的降解過程。黃明等[27]在試驗中發現caspase-3的專一抑制劑可以使雞肉樣品的多種骨架蛋白降解受抑制。從微觀角度看,肌肉的成熟嫩化是肌細胞發生凋亡進而繼發性壞死的過程,因此,細胞凋亡與肌肉的成熟嫩化有著密切的關系。

4 NF-κB在肌肉嫩化機制研究中的前景

肌肉嫩化機理學說有很多種,如肌肉自身成熟機制的“酶假說”,認為鈣蛋白酶(calpain)系統經肌質網釋放 Ca2+激活后,calpain對細胞骨架進行降解,導致細胞支撐體系瓦解,從而改善肌肉的嫩度。對此已有報道研究了不同飼喂方式、不同的飼糧蛋白質水平對豬背最長肌鈣蛋白酶抑制蛋白表達量及嫩度的影響[28-29]。又如外界刺激導致肌肉成熟機制的理論,認為通過一定外界刺激加強肌肉收縮,肌動蛋白細絲過度插入引起 Z線斷裂,肌原纖維結構松弛,進而改善肌肉的嫩度[30]。而目前,國內外研究人員均沒有對動物屠宰后骨骼肌細胞的凋亡在肌肉嫩化中的作用機制進行深入研究。

NF-κB廣泛存在于多種組織細胞中,激活后參與多種因子的轉錄調控,與細胞的凋亡存在密切關系。研究表明,NF-κB可以促進細胞凋亡,激發細胞凋亡酶家族,降解細胞骨架蛋白[4]。NF-κB很可能參與了肉的嫩化過程,然而對于 NF-κB的研究大部分停留在人類和動物的疾病防預及治療方面,在動物肉品質上的研究甚少。因此,深入研究二者之間的聯系,便可以通過對 NF-κB的調節來誘導細胞凋亡,控制凋亡速率,進而可以縮短肌肉的成熟嫩化時間,調控和改善肉品質。

5 小 結

NF-κB是一種多功能轉錄因子,以往多限于在免疫細胞及各種疾病中的研究,在骨骼肌中,其研究剛剛起步。NF-κB在細胞凋亡中的作用已經逐漸明朗,細胞凋亡與肌肉嫩度的關聯性也得到證實,因此,在動物營養領域的研究中,對 NF-κB作用的研究將極具前景。

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