咖啡酸苯乙酯對糖尿病大鼠視網膜VEGF和ICAM-1表達的影響

袁 鵬 臧嬋媛 周 偉 劉學政

糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病最具破壞性的眼部并發癥，DR可對視力造成不可挽回的影響，早期預防和治療DR成為研究者關注的熱點。咖啡酸苯乙酯（CAPE）是一種從蜂膠中分離出的酚類物質，具有抗炎、抗氧化應激和免疫調節作用，為一種有效的特異性核因子（KF）-κB抑制劑[1]。糖尿病狀況下，升高的炎性介質、活性氧化產物和糖基化終末產物可作為細胞外信號進一步激活NF-κB[2]。本實驗旨在研究CAPE對糖尿病大鼠視網膜細胞間黏附因子（ICAM）-1和視網膜血管內皮生長因子（VEGF）蛋白表達的影響，以期觀察CAPE在治療DR中的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 雄性清潔級SD大鼠40只，體質量200～220 g，購自遼寧醫學院實驗動物中心，于溫度為25℃、濕度為40%的動物房普通飼料喂養。鏈脲佐菌素（STZ）購自Sigma公司，CAPE購自美國IL公司，VEGF和ICAM-1酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒購自武漢博士德公司；One TouchⅡ血糖測定儀購自美國強生Lifescan公司，超聲波細胞破碎儀（VCX105型，Sonics&materials公司），離心機（1-14型，Sigma公司），酶標儀（DNM-9606型，北京普朗新技術有限公司）。

1.2 模型制備與分組 大鼠禁食12 h后，按45 mg/kg尾靜脈注射1%STZ溶液[0.1 mol/L的檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5）配制]；48 h后尾靜脈采血測血糖，以后每月測1次，將血糖濃度大于16.7 mmol/L的大鼠定為糖尿病模型大鼠。取30只糖尿病模型大鼠隨機分為3組，每組10只：DM組不使用任何藥物，CAPE5組按5 mg/kg每3 d腹腔注射CAPE，CAPE10組按10 mg/kg每3 d腹腔注射CAPE，3個月后以上3組各剩下8、8、9只大鼠。另取10只SD大鼠，注射等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液作為正常對照組（CON組）。

1.3 ELISA檢測視網膜VEGF和ICAM-1蛋白水平 水合氯醛麻醉全部大鼠并斷頸處死，迅速摘除大鼠雙側眼球（左眼用于VEGF蛋白水平測定，右眼用于ICAM-1蛋白水平測定），顯微鏡下，沿角膜鞏膜緣切開眼球，去除晶體及玻璃體，剪碎視網膜，加入150 μL預冷的組織裂解液。裂解液組成：20%甘油，10 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton），300 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L二硫蘇糖醇，0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟，20 mmol/L羥乙基哌嗪乙磺酸（pH 7.9）。視網膜在冰浴中超聲粉碎2個循環，每個循環5 s，4℃下14 000 r/min離心15 min，取上清液2 μL使用BCA法進行蛋白定量，另取100 μL上清液按試劑盒說明書檢測視網膜組織中的VEGF和ICAM-1水平。

1.4 統計學處理 采用SPSS 11.5軟件進行分析，計量資料數據以±s表示，多組資料比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

4組大鼠視網膜VEGF和ICAM-1蛋白水平差異有統計學意義（均P＜0.01）。除CAPE5和CAPE10組間VEGF水平差異無統計學意義外（均P＞0.01），其他各組兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.001），見表1。

表1 4組大鼠視網膜VEGF及ICAM-1水平比較（μg/g，±s）

表1 4組大鼠視網膜VEGF及ICAM-1水平比較（μg/g，±s）

＊＊P＜0.01

CON（1）DM（2）CAPE5（3）CAPE10（4）F 10 889 0.85±0.11 2.43±0.17 1.45±0.19 1.41±0.22 125.05＊＊組比（1）∶（2）（2）∶（3）（3）∶（4）（2）∶（4）P＜0.001＜0.001 0.666＜0.001 3.71±0.15 7.97±0.26 5.69±0.32 4.43±0.19 564.84＊＊組比（1）∶（2）（2）∶（3）（3）∶（4）（2）∶（4）P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001統計學處理 統計學處理組別 n VEGF水平ICAM-1水平

3 討論

許多炎性介質和細胞因子參與了DR的發生與發展，這些因子相互作用形成網狀結構和相互關聯的作用通路，共同影響DR的發生和發展，因此對這些細胞因子及其下游通路的抑制已成為治療早期DR的重要方法。

Joussen等[3]研究表明DR與慢性炎癥反應有諸多相似之處，ICAM-1介導的白細胞和視網膜毛細血管內皮細胞之間的黏附在DR的發生發展中起始動作用，白細胞黏附可引起視網膜毛細血管內皮細胞的凋亡、毛細血管無灌注的形成及血視網膜屏障的破壞，使用ICAM-1中和抗體可對DR起保護作用[4]。本研究結果表明，CAPE能明顯抑制糖尿病大鼠視網膜ICAM-1蛋白的表達水平，從而抑制糖尿病大鼠早期視網膜病變。

VEGF是受NF-κB調控的促血管生長因子之一[5]，VEGF可通過誘導ICAM-1的表達引起炎癥反應，是血視網膜屏障破壞和視網膜新生血管形成的主要調節因子，在DR的發生發展中起到重要作用。本研究結果表明，使用CAPE后糖尿病大鼠視網膜的VEGF蛋白表達水平得到了明顯抑制，因此CAPE可通過抑制VEGF的蛋白表達水平對DR起保護作用。

活化的NF-κB可介導ICAM-1、白介素-1β、腫瘤壞死因子-α和環氧酶-2等與DR發生密切相關的細胞因子的表達，被視為糖尿病微血管病變的中心調控因子。作為一種有效的特異性NF-κB抑制劑，CAPE可能通過抑制糖尿病狀況下升高的NF-κB的轉錄活性減少VEGF和ICAM-1的表達。同時CAPE還可能通過抑制TGF-β2信號轉導通路間接對VEGF的表達進行調控[6]。CAPE對ICAM-1和VEGF蛋白表達水平的機制還有待深入研究，這也將為CAPE治療DR提供進一步的理論依據。

[1]Natarajan K,Singh S,Burke TR Jr,et al.Caffeic acid phenethyl ester is a potent and specific inhibitor of activation of nuclear transcrip?tion factor NF-kappa B[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(17): 9090-9095.

[2]Kowluru RA,Odenbach S.Role of interleukin-1beta in the patho?genesis of diabeticretinopathy[J].Br J Ophthalmol,2004,88(10): 1343-1347.

[3]Joussen AM,Poulaki V,Le ML,et al.A central role for inflamma?tion in the pathogenesis of diabetic retinopathy[J].Faseb,2004,8(12): 1450-1452.

[4]Miyamoto K,Khosrof S,Bursell SE,et al.Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopa?thy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(19):10836-10841.

[5]Bian ZM,Elner SG,Elner VM.Regulation of VEGF mRNA expres?sion and protein secretion by TGF-beta2 in human retinal pigment epithelial cells[J].Exp Eye Res,2007,84(5):812-822.

[6]Fujioka S,Sclabas GM,Schmidt C,et al.Inhibition of constitutive NF-kappa B activity by I kappa B alpha M suppresses tumorigene?sis[J].Oncogene,2003,22(9)：1365-1370.