氣腹預(yù)處理在家兔氣腹模型中減輕肺損傷作用的研究*

包延麗 寧加娟 李雪梅

CO2注入腹腔使腹內(nèi)壓增高可引起腹腔內(nèi)血管血流阻力增高、灌注不足，從而導(dǎo)致內(nèi)臟缺血，而放氣降低了腹壓，增加了臟器的灌注，因而在腹腔鏡手術(shù)過程中出現(xiàn)了類似缺血/再灌注現(xiàn)象[1]。研究表明，氣腹預(yù)處理有類似缺血預(yù)處理的作用，可以減輕腹腔鏡氣腹造成的腹內(nèi)臟器氧化損傷[2]，但預(yù)氣腹是否有減輕肺組織損傷的作用尚少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以家兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象對(duì)此方面進(jìn)行了初步研究和探討，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 普通級(jí)健康新西蘭大耳白兔40只購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，月齡3～5個(gè)月，雌雄不拘，質(zhì)量2.8～3.2 kg。髓過氧化物酶（MPO）活性試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，丙泊酚注射液（力蒙欣，20 mL：200 mg，西安力邦制藥），OLYMPUS UHI-2全自動(dòng)氣腹機(jī)（日本）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 按隨機(jī)數(shù)字法將40只家兔分為4組，即對(duì)照組（N組，假氣腹組）、短時(shí)間氣腹組（S組，氣腹時(shí)間持續(xù)1 h）、長(zhǎng)時(shí)間氣腹組（L組，氣腹時(shí)間持續(xù)3 h）、氣腹預(yù)處理組（P組，氣腹5 min后解除氣腹5 min，再次建立氣腹并持續(xù)3 h），每組10只。剔除標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)中由于建立氣腹模型而致皮下氣腫者、各種原因?qū)е聡g(shù)期心跳驟停和自主呼吸停止者。實(shí)際納入研究的家兔為N組10只、L組9只、S組9只、P組8只。

1.2.2 麻醉及氣腹模型的建立 全組麻醉前禁食6 h，耳緣靜脈滴注生理鹽水（4 mL·kg-1·h-1）以補(bǔ)充非顯性失水，靜脈注射丙泊酚5～7 mg/kg麻醉誘導(dǎo)（注射時(shí)間大于2 min），待家兔四肢及尾部放松、睫毛反射消失后將動(dòng)物固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，給于0.5 L/min的鼻導(dǎo)管供氧，麻醉維持丙泊酚20～30 mg·kg-1·h-1，持續(xù)微量泵泵入。切開頸部正中皮膚，鈍性分離各層組織，行左頸總動(dòng)脈穿刺置管，連接壓力換能器進(jìn)行動(dòng)脈有創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)，術(shù)中根據(jù)家兔肢體動(dòng)作及血壓、心率情況，酌情追加丙泊酚，力求心率、血壓等各項(xiàng)指標(biāo)接近生理值狀態(tài)，以排除血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。使用20號(hào)硬膜外穿刺針替代氣腹針建立氣腹模型，除對(duì)照組不做氣腹外，其余各組CO2腹內(nèi)壓力恒定于8 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。

1.2.3 觀察指標(biāo)和樣品采集 （1）血漿蛋白樣本采集：各組均于氣腹建立前采集動(dòng)脈血，用于測(cè)定血漿總蛋白含量。（2）支氣管肺泡灌洗液（BALF）采集及處理:解除氣腹后20 min，迅速剪開胸骨柄暴露肺組織并切斷氣管，止血鉗夾閉右主支氣管后，用4℃生理鹽水分3次行支氣管肺泡灌洗，灌洗液量分別為5、2、2 mL，每次灌洗均反復(fù)抽吸3次，將所得肺泡灌洗液用2層消毒紗布過濾，置入離心管中離心（4℃，3 000 r/min，15 min），取上清液檢測(cè)BALF蛋白含量，取下層沉淀液檢測(cè)白細(xì)胞（WBC）計(jì)數(shù)。（3）肺組織濕（W）、干（D）質(zhì)量測(cè)定：結(jié)扎右肺中間葉并將其切除，取其核心部位一小塊組織，用濾紙吸干肺組織表面血污后放入稱過質(zhì)量的玻璃試管中，稱濕質(zhì)量后置入60℃電熱恒溫干燥箱中，7 d后測(cè)干質(zhì)量。（4）肺組織MPO活性測(cè)定：取肺組織小塊于-80℃深低溫冰箱冷凍保存，用化學(xué)比色法測(cè)定肺組織MPO活性。（5）肺組織病理切片制作：取右肺組織約20 g，10%福爾馬林固定、石蠟包埋、切片。

1.2.4 觀察指標(biāo)計(jì)算公式 肺通透指數(shù)（LPI）=BALF總蛋白/血漿總蛋白；MPO活力單位（×10-3U/mg）=（A3-A1）/1 000×肺質(zhì)量（mg，A3-A1為第3 min和第1 min吸光度之差）；肺組織含水量（%）=（肺濕質(zhì)量-肺干質(zhì)量）/肺濕質(zhì)量×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或M（P25，P75）表示，組間各均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織損傷指標(biāo)比較 （1）肺組織含水量：N、S、P 3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），N、P及S組均低于L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。（2）LPI：N、S、P 3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但均小于L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（3）BALF中WBC計(jì)數(shù)：L組明顯高于其他3組（P＜0.01），P組明顯高于N組（P＜0.01），S組與N組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（4）肺組織MPO活力：L組明顯大于其他3組（P＜0.01），P組大于N組（P＜0.05），N組與S組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組肺組織損傷觀察指標(biāo)及比較結(jié)果

2.2 各組肺組織病理改變 N組：肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)無水腫，肺泡腔內(nèi)未見明顯蛋白液滲出及中性粒細(xì)胞聚集，肺組織血管及部分支氣管周未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1。S組：肺泡壁結(jié)構(gòu)尚完整，局灶肺間質(zhì)水腫，肺泡間隔稍增厚，肺組織小血管周及部分支氣管周見少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖2。P組：肺泡壁結(jié)構(gòu)尚完整，局灶肺間質(zhì)水腫，肺泡壁間隔增厚，肺組織小血管周及部分支氣管周見少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖3。L組：局部肺泡壁斷裂，肺間質(zhì)水腫，肺泡間隔增厚，肺組織彌漫性充血出血，肺泡腔內(nèi)紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞聚集，肺組織小血管周及部分支氣管周見較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)少許蛋白液滲出，見圖4。

3 討論

氣腹導(dǎo)致的缺血/再灌注現(xiàn)象被認(rèn)為是造成肝腎組織損害、超微結(jié)構(gòu)改變的主要原因[3]。氣腹后大鼠的肝、肺等組織發(fā)生脂質(zhì)過氧化和氧自由基增加[4]。國(guó)外有學(xué)者對(duì)預(yù)施腹腔鏡手術(shù)動(dòng)物先進(jìn)行5～10 min的氣腹預(yù)處理，結(jié)果表明氣腹預(yù)處理（預(yù)氣腹）有類似缺血預(yù)處理的作用，能更有效減輕氣腹所致的肝腎小腸等臟器的氧化損傷[5-6]。本實(shí)驗(yàn)將LPI及肺組織含水量等指標(biāo)作為觀察氣腹及氣腹預(yù)處理時(shí)家兔肺損傷情況的判斷指標(biāo)，因急性肺損傷時(shí)肺泡上皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，通透性增高，使血漿及蛋白成分外滲，引起肺間質(zhì)和肺泡水腫，嚴(yán)重者可致小血管破裂，肺泡腔出血，所以LPI及肺組織含水量等指標(biāo)在某種程度上可反映肺組織損傷程度。本研究中L組肺組織含水量和LPI大于其他各組，P組與對(duì)照組、S組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示氣腹時(shí)間超過3 h可以導(dǎo)致肺損傷，而氣腹預(yù)處理在一定程度上減輕了肺損傷。另一肺損傷指標(biāo)為肺MPO活力，MPO是中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear leuko?cyte，PMN）嗜天青顆粒釋放的過氧化物酶類，其活性與PMN數(shù)量呈正比，是PMN標(biāo)志酶，其有弱的過氧化氫酶活性，參與中性粒細(xì)胞氧代謝，最終產(chǎn)物次氯酸、活性氧分子等可加重肺損傷，肺MPO活力常用來表示中性粒細(xì)胞肺內(nèi)滯留指數(shù)，其變化可敏感反映組織早期損傷。本研究顯示，在長(zhǎng)達(dá)3 h的CO2氣腹后肺MPO活力明顯高于1 h氣腹組和對(duì)照組，BALF中WBC計(jì)數(shù)明顯增多，說明PMN在肺內(nèi)大量聚集可能是造成L組肺損傷的原因之一，P組肺組織MPO活力明顯小于L組，且BALF中WBC較L組減少，提示P組預(yù)氣腹所引發(fā)的類似缺血預(yù)處理現(xiàn)象，在一定程度上減輕了長(zhǎng)時(shí)間氣腹所導(dǎo)致的肺損傷，該作用可能是通過抑制PMN在肺內(nèi)的聚集達(dá)到的。

圖1 N組肺組織光鏡觀察（HE×200）

圖2 S組肺組織光鏡觀察（HE×200）

圖3 P組肺組織光鏡觀察（HE×200）

圖4 L組肺組織光鏡觀察（HE×200）

肺組織病理切片可見，L組有炎細(xì)胞浸潤(rùn)以及肺泡壁變薄、斷裂，肺泡腔擴(kuò)張、融合加劇。而炎細(xì)胞的浸潤(rùn)與細(xì)胞損傷有關(guān)。這種損傷的機(jī)制包括肺組織細(xì)胞缺血缺氧、組織缺血再灌注以及中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)所伴隨的腺苷三磷酸的大量消耗等，這些影響最終導(dǎo)致了肺組織在CO2氣腹后發(fā)生損傷。

[1]Glantzounis GK,Tselepis AD,Tambaki AP,et al.Laparoscopic sur?gery-induced changes in oxidative stress markers in human plasma [J].Surg Endosc,2001,15(11):1315-1319.

[2]Ates E,Yilmaz S,Ihtiyar E,et al.Preconditioning-like amelioration of erythropoietin against laparoscopy-induced oxidative injury[J]. Surg Endosc,2006,20(5):815-819.

[3]稽武,陳訓(xùn)如,周正東,等.CO2氣腹對(duì)兔肝腎功能的影響機(jī)制[J].世界華人消化雜志,1999,7(10):897-899.

[4] Sare MJ,Hamamci DG,Yilmaz IL,et al.Effects of carbon dioxide pneumoperitoneum on free radical formation in lung and liver tis?sues[J].Surgical Endoscopy,2002,16(1):188-192.

[5]Cevrioglu AS,Yilmaz S,Koken T,et al.Comparison of the effects of low intra-abdominal pressure and ischaemic preconditioning on the generation of oxidative stress markers and inflammatory cytokines during laparoscopy in rats[J].Hum Reprod,2004,19(9):2144-2151.

[6]Yilmaz S,Ates E,Polat C,et al.Ischemic preconditioning decreases laparoscopy-induced oxidative stress in small intestine[J].Hepato?gastroenterology,2003,50(52):979-982.