喉癌中肝細胞再生磷酸酶-3的表達及與微血管密度的相關性*

胡海麗 董雪蕾 田秀芬

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，近年來發病率呈明顯增加的趨勢,其中95%～98%為鱗狀細胞癌。喉癌的復發和轉移仍是影響5年生存率的主要原因。新生血管形成在惡性腫瘤侵襲、轉移過程中起核心作用，腫瘤血管內皮細胞的生長速度是正常組織血管內皮細胞生長速度的200～2 000倍。本研究通過檢測喉癌組織和癌旁組織中肝細胞再生磷酸酶-3（PRL-3）表達情況及微血管密度（MVD）計數情況，分析PRL-3與MVD在相關性及二者在喉鱗狀細胞癌各病理因素中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇鄭州大學第一附屬醫院2006年1月—2008年12月收治的69例喉鱗狀細胞癌患者的癌組織標本，所有患者臨床資料完整，術前均未進行放療、化療及任何免疫治療。其中高分化鱗癌28例，中分化鱗癌15例，低分化鱗癌26例。有淋巴結轉移者25例，無淋巴結轉移者44例。按國際抗癌協會（UICC）TNM分類標準（2002）分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期15例，Ⅲ期27例，Ⅳ期16例。另取25例同批患者的癌旁組織為對照，癌旁組織取自肉眼觀察距腫瘤邊緣1.0 cm以外的喉黏膜組織，均經病理證實未發現癌細胞。

1.2 試劑與設備 PRL-3羊抗人多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），PRL-3二抗PV9003試劑盒、DAB顯色劑、鼠抗人單克隆抗體CD105（北京中杉金橋生物工程有限公司）。圖像采集采用Lecia顯微照像系統（德國）。圖像分析采用Biosens Digital Imaging System v1.6（上海山富科學儀器有限公司）。

1.3 方法及結果判定 嚴格按照試劑盒說明書步驟，采用免疫組化SABC法檢測標本PRL-3。免疫組化染色結果根據染色強度和陽性細胞數比例綜合評分,染色強度評分：無染色0分，淡黃色顆粒1分，淺棕黃色顆粒2分，深棕黃色顆粒3分。陽性細胞數比例評分：每片隨機觀察5個高倍視野，計數500個細胞中染色陽性細胞數，陽性細胞數＜5%為0分；陽性細胞數5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。將染色強度評分與陽性細胞數比例評分相加，其和＜2分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分為中度陽性（++），6～7分為強陽性（+++）。

MVD計數方法:CD105定位于血管內皮細胞胞膜和胞漿，陽性者被染成棕黃色，組織MVD計數按照Weidner等[1]的方法并加以改進，先在100倍光鏡下尋找腫瘤中血管密度最高的5個區域，然后在200倍光鏡下計數微血管的數目，5個區域的均值為該腫瘤的MVD，不論有無管腔，看到單個孤立內皮細胞或多個內皮細胞緊密排列均計數為1個血管,呈管狀者只要結構不相連續，分支結構也作為1個血管計算。分辨不清或染色模糊的細胞不計數，MVD計數單位為個/高倍視野（個/HP）。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件包進行統計分析，樣本率的比較采用χ2檢驗，計量資料用±s表示，均數比較采用t驗，PRL-3與MVD相關性采用Spearman等級相關分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 PRL-3在癌組織及癌旁組織中的表達和MVD計數情況 PRL-3表達陽性的喉鱗狀細胞癌組織，在鏡下表現為腫瘤細胞內出現棕黃色顆粒，且主要定位于腫瘤細胞的細胞漿，見圖1、2。25例癌旁組織中陽性表達2例（8%），69例喉鱗癌組織中陽性表達45例（65.22%），差異有統計學意義（χ2=24.031，P＜0.01）。CD105主要定位于血管內皮細胞的細胞膜和細胞質，呈棕黃色，用于標記MVD，鏡下見新生血管管腔結構大小不一，形態不規則，部分可見管腔結構，部分僅見內皮細胞呈線狀或者點狀分布，見圖3～5。

2.2 PRL-3的表達和MVD計數與喉鱗癌的臨床病理特征關系 低分化患者的PRL-3陽性表達率高于高、中分化患者，臨床病理分期Ⅲ～Ⅳ期的PRL-3陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴結轉移患者的PRL-3陽性表達率高于無淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。臨床病理分期Ⅲ～Ⅳ的MVD高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴結轉移患者的MVD高于無淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。不同分化程度患者的MVD比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

圖1 PRL-3在癌旁組織陰性表達（SABC法×200）

圖2 PRL-3在喉鱗狀細胞癌組織陽性表達（SABC法×200）

圖3 CD105標記的MVD在癌旁組織中（SABC法×200）

圖4 CD105標記的MVD在Ⅱ期喉鱗狀細胞癌組織中（SABC法×200）

圖5 CD105標記的MVD在Ⅳ期喉鱗狀細胞癌組織中（SABC法×200）

表1 喉鱗癌中PRL-3陽性表達和MVD計數與臨床病理指標的關系

2.3 PRL-3的表達與MVD的關系 PRL-3表達為+++、++、+及-時的MVD分別為（16.615 4±2.363 0）、（12.187 5±1.978 0）、（10.437 5±1.037 1）及（9.125 0±1.541 1）個/HP。經Spearman等級相關分析，PRL-3表達與MVD呈正相關（rs=0.811，P＜0.01）。

3 討論

喉癌的浸潤和轉移是多步驟、多階段、復雜且連續的過程，涉及形成血管，進入脈管系統并在繼發的組織器官中生長，最后癌細胞進入淋巴管或血管，形成癌栓并到達特定的組織器官，最終形成轉移灶。PRL-3屬蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP酶）家族中的一員，目前對PRL-3的研究集中在刺激細胞增殖、抑制細胞凋亡、調節血管形成幾個方面，已在肝癌[2]、結腸癌[3]、胃癌[4]、乳腺癌[5]、食管癌[6]、前列腺癌[7]等腫瘤的研究中確認，但至今有關PRL-3在喉鱗癌組織表達水平的相關研究報道尚少。本研究表明PRL-3在喉鱗狀細胞癌中存在過度表達，主要集中于腫瘤細胞的細胞漿，鏡下呈現棕黃色顆粒，且喉鱗狀細胞癌組織中PRL-3的陽性表達率高于癌旁組織，差異有統計學意義。本研究還發現有淋巴結轉移患者的PRL-3陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移患者，臨床病理分期較晚的Ⅲ～Ⅳ期組織PRL-3的陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期的早期患者，提示PRL-3的高表達與腫瘤的浸潤及頸淋巴結轉移有關，PRL-3可作為一種新的腫瘤標志物用于監控喉癌進展。

Guo等[8]通過體外培養表達PRL-3的細胞與人臍靜脈內皮細胞，證實表達PRL-3的細胞可以增強人臍靜脈內皮細胞的血管形成。CD105又名endog?lin，CD105陽性染色主要定位于血管內皮細胞的細胞膜和細胞質,在大血管內皮細胞膜和細胞質中不表達[9]。因此本研究選擇CD105對腫瘤的MVD進行標記。

本研究發現淋巴結轉移患者的MVD高于無淋巴結轉移組，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期MVD高于Ⅰ～Ⅱ期，差異有統計學意義，提示MVD值越高發生頸淋巴結轉移的概率越大，腫瘤侵襲性越強，MVD可作為反映喉癌淋巴結轉移的一個重要指標,為抗血管形成治療提供依據[10]。本研究還發現，PRL-3表達陽性的評分越高，MVD值越高，血管生成越活躍，PRL-3對血管生成有促進作用，MVD的表達與PRL-3的表達呈正相關，提示PRL-3可能通過血管生成途徑參與喉鱗狀細胞癌的浸潤及轉移。

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