人源Fab段噬菌體抗體庫的構建及抗IL-4抗體的初步篩選*

胡占東 公 倩 朱鐵虹 暢繼武

白細胞介素（IL）-4是具有多種生物學功能的細胞因子。在細胞免疫和體液免疫中發揮重要作用。新近研究表明，IL-4與哮喘、腎臟疾病和腫瘤等疾病的發病機制密切相關[1-2]。但由于傳統檢測技術較復雜，研究IL-4與上述疾病的內在相關性存在困難。因此尋找一種快速而具有高度特異性的方法是研究IL-4的關鍵。噬菌體抗體庫是在噬菌體展示技術的基礎上建立起來的。該技術不經免疫，避免了雜交瘤技術繁瑣過程，直接通過噬菌體展示人源抗體。本研究運用這一技術構建了大容量的人源噬菌體抗體元件庫，并從中篩選得到IL-4-Fab抗體，為進一步解決IL-4抗體的表達與純化，制備新型的檢測試劑盒奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）試劑。RNA提取純化試劑TRIzol購自Invit-rogen公司；逆轉錄試劑盒（Quantscript RT KIT），DNA聚合酶（2XTaq PCR Master Mix），質粒提取試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒購自北京TIANGEN公司；T4 DNA連接酶和限制性內切酶SpeⅠ、XhoⅠ、SacⅠ和XbaⅠ購自TaKaRa公司；胰化蛋白胨和酵母提取物購自英國Oxoid公司，氨芐青霉素（Amp）、四環素（Tet）、卡那霉素（Kan）、Tween20、PEG8000，Tris堿、牛血清白蛋白（BSA）和IL-4均購自Sigma公司。（2）載體、宿主菌與輔助噬菌體。具有抗氨芐青霉素特性的噬菌粒載體pComb3XSS由美國Scripps研究所CarlosF.Barbas博士贈送。大腸桿菌XL1-Blue由本室保存。輔助噬菌體VCSM13含卡那霉素抗性基因，購自美國Stratagene公司。（3）PCR引物。參考美國Scripps研究所設計的一組引物[3]，由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 重鏈Fd和輕鏈基因的獲得 抽取來自天津市泌尿外科研究所18例健康成人外周血，分離淋巴細胞。每1×107細胞加入1 mL TRIzol充分裂解細胞，提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA。以Oligo（dT）15為引物，用Quantscript RT試劑盒逆轉錄為cDNA，分別以重鏈和輕鏈5端和3端引物[3]的不同組合聚合酶鏈反應（PCR）擴增重鏈Fd段和輕鏈基因片段。擴增條件為：94℃預變性3 min。94℃變性1 min，退火溫度因引物的不同組合在52℃～58℃之間變動時間為45 s，72℃延伸1 min。30～32循環后72℃延長10 min。瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化擴增的DNA，-20℃保存備用。重鏈5端引物含XhoⅠ酶切位點CTCGAG，3端引物含SpeⅠ位點ACTAGT。輕鏈5端引物含SacⅠ位點GAGCTC，3端引物含XbaⅠ位點TCTAGA。

1.2.2 人源Fab抗體庫的構建及鑒定 將輕鏈PCR產物混合和載體pComb3XSS分別用SacⅠ和XbaⅠ雙酶切，電泳后回收純化DNA。取載體pComb3XSS的酶切片段與輕鏈PCR酶切片段，在連接酶作用下16℃過夜。將連接產物加入感受態細胞XL1-blue，進行電轉化，搖菌培養構建輕鏈庫[4]。提取輕鏈庫的質粒，經SacⅠ和XbaⅠ酶切鑒定。后將輕鏈庫噬粒DNA和重鏈Fd段PCR產物分別用XhoⅠ和SpeⅠ雙酶切，電泳回收目的條帶基因，連接，電轉化感受態細胞，加入3 mL預熱SOC培養基，37℃振蕩培養1 h后取部分稀釋后鋪板，其余加入10 mL預熱的SB+A+T培養基，37℃振蕩培養1 h后加Amp至100 mg/L，振蕩1 h，加入輔助噬菌體VCSM13約1012pfu/mL混勻后并入100 mL SB+A+T培養基，振蕩培養2 h后加入Kan至70 mg/L后振蕩培養過夜。次晨離心收集上清后加入PEG沉淀液，冰浴后離心棄上清，1%BSA-PBS溶解沉淀后離心收集上清即為構建的人源Fab段抗體庫。取噬菌體Fab段抗體庫上清感染對數生長期的XL1-blue菌液，鋪板過夜培養，測定庫容?？贵w庫酶切鑒定：從平板上隨機抽取10個菌株，提取質粒，經XhoⅠ和SpeⅠ、SacⅠ和XbaⅠ、SacⅠ和SpeⅠ，雙酶切，XhoⅠ單酶切鑒定。

1.2.3 抗IL-4-Fab抗體的篩選 參考文獻[5]方法，以IL-4為抗原包被于96孔板中，次日3%BSA-PBS封閉后加入新鮮制備的抗體庫上清，濕盒中37℃孵育2 h；棄抗體庫液，用含0.05%Tween-20的PBS洗去未結合的噬菌體抗體。用pH為2.2的Gly-HCl緩沖液洗脫后以2 mol/L Tris中和至中性，感染2 mL對數生長期的大腸桿菌XL1-blue后37℃孵育1 h。取100 μL梯度稀釋后鋪板測定滴度，計算每輪篩選的產出率；余菌進行下一輪的富集，共5輪。

1.2.4 噬菌體-酶聯免疫吸附法（Phage-ELISA）檢測和陽性克隆基因測序 從第5輪篩選的平板上隨機抽取30個單克隆分別制備噬菌體抗體上清。包被IL-4抗原于酶標板上，同時設空載體pComb3XSS噬菌體、無關抗原BSA作為陰性對照。3%BSA-PBS封閉后加入噬菌體抗體上清[6]，37℃孵育2 h。PBST沖洗，加入HA-Tag小鼠單抗，37℃孵育1 h后沖洗，加入HRP-山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1 h，洗板后加TMB顯色，酶標儀測A450值，取A450值最高的陽性菌株測序。

2 結果

2.1 重鏈Fd和輕鏈基因片段的獲得 PCR擴增重鏈Fd和輕鏈基因片段，純化產物經瓊脂糖凝膠電泳，于680 bp處可見特異性的目的基因片段，見圖1。

2.2 人源Fab抗體庫的構建及鑒定 輕鏈庫質粒雙酶切，10個克隆均顯示出680 bp左右的片段，見圖2。構建的Fab段抗體庫，計算菌落測定庫容為2.4×108。構建的全庫單克隆經提取質粒電泳，見圖3。酶切鑒定：（1）SpeⅠ和XhoⅠ酶切重組質粒pComb3XSS，鑒定重鏈Fd的插入，經電泳可見10個質粒中9個顯示出680 bp大小片段，見圖4。（2）SacⅠ/ SpeⅠ酶切重組質粒pComb3XSS鑒定Fab的插入，見圖5。電泳顯示10個質粒中有8個含有約1 500 bp左右的基因片段，重組率為80%。

2.3 IL-4噬菌體抗體的初步制備與鑒定 以IL-4為抗原對抗體庫進行5輪篩淘，篩選下來的噬菌體抗體滴度分別為4.7×104、1.04×105、2.4×105、5.1×106、1.6×107。第5輪比第1輪噬菌體抗體滴度增加340倍，ELISA檢測篩選抗體的抗原結合活性，其中有5個呈陽性，陽性率為16.7%。A450值最高的單克隆質粒測序結果顯示輕鏈核苷酸序列與λ鏈序列同源性為94%，重鏈核苷酸序列與人免疫球蛋白γ鏈同源性為91%。

3 討論

利用雜交瘤技術制備的單克隆抗體在疾病的診斷、治療等方面發揮了重要的作用[7]。但由雜交瘤技術制備的動物源性抗體容易引起排異反應，且制備過程復雜，因此限制了其應用。制備人源化抗體能解決上述不足。將人抗體基因片段組裝到載體內,然后展示到噬菌體表面得到多樣性噬菌體抗體的集合即為人源噬菌體抗體庫，可從中篩選到人源化的抗體。噬菌體抗體庫技術因而成為制備人源抗體的一項重要技術。用此方法對選定的抗原篩選特異性抗體，時間短，價格低廉，并能大量制備人源化抗體。此法克服了人單克隆抗體雜交瘤細胞中抗體不穩定、容易丟失的不足及人源抗體來源的困難。

抗體庫的構建是獲得特異性人源抗體的先決條件，其制約因素有抗體片段的形式、基因來源、抗體庫的容量和多樣性等。目前人源抗體庫主要有2種形式：ScFv和Fab，ScFv是通過化學鍵把抗體重輕鏈的可變區連接起來，其特點是表達產量高，但易形成多聚體[8]，在人體內易被代謝，而Fab是表達的重鏈的Fd段和完整的輕鏈通過二硫鍵形成異二聚體，其產量較ScFv低，但在人體內較穩定。研究表明，Fab段抗體含有完整的輕鏈和重鏈的第一恒定區，具有與抗原結合的獨立功能，經儲存1年后，活性無明顯變化[9]，Fab段抗體易轉化成結合抗原的功能分子?；谏鲜鲆蛩兀緦嶒灷檬删w抗體展示技術構建了人源Fab段噬菌體抗體庫，為今后篩選更優質抗體的工作奠定了基礎?？贵w基因的來源，庫容與多樣性同樣影響抗體庫的質量。本研究從18例健康成人的外周血淋巴細胞中提取總RNA，經40多對引物擴增出Fab抗體基因片段，采用電轉化法進行多次轉化，構建出庫容約2.4×108的人源Fab段抗體庫，陽性克隆提取質粒，經酶切鑒定重組率為80%，表明庫構建良好。

大腸桿菌中能否成功表達Fab段基因，載體的選擇與設計是關鍵[10]。本實驗選擇噬菌粒pComb3XSS作為載體構建抗體元件庫。在pComb3的基礎上進行了改進，其優點在于增加了載體的穩定性；帶有6×His及HA-Tag，為以后的抗體純化與檢測搭起橋梁；引入琥珀酸終止密碼子，可終止pⅢ融合蛋白的表達，為抗體表達做準備。

實驗中，筆者采用固相化抗原吸附法，將IL-4以遞減的稀釋濃度包被于96孔板上，選擇適當強度，在保證克隆穩定的前提下，對構建的抗體庫進行5輪篩選，可以看到特異性Fab段抗體的得到約340倍的富集。Phage-ELISA檢測顯示篩選到的噬菌體抗體具有一定的IL-4結合活性和特異性，陽性克隆在提取質粒后進行DNA測序，用NCBI中的Nu?cleotide Blast軟件對其序列進行分析，結果顯示抗體重鏈屬IgG亞類，輕鏈為λ鏈，序列同源性均在90%以上。這表明該方法篩選成功率高，且操作簡便易行，為體外大規模生產人源抗體和檢測血中IL-4水平，提供簡便價廉有效的方法。利用該技術有望篩選出優質的人源性IL-4-Fab抗體，運用于臨床診治中。

[1]Chiba Y,Goto K,Momata M,et al.Induction of RhoA gene expres?sion by interleukin-4 in cultured human bronchial smooth muscle cells[J].J Smooth Muscle Res,2010,46(4):217-224.

[2]范興忠,李宏.腎病綜合征患者血清IL-4和IL-10水平的變化及意義[J].免疫學雜志,2010,26(1):56-62.

[3]Shui X,Huang J,Li YH,et al.Construction and selection of human Fab antibody phage display library of liver cancer[J].Hybridoma, 2009,28(5):341-347.

[4]Dantas-Barbosa C,Brígido MM,Maranh?o AQ.Construction of a human Fab phage display library from antibody repertoires of osteo?sarcoma patients[J].Genet Mol Res,2005,4(2):126-140.

[5]萬佳藝,孫慧,焦永軍,等.人源天然Fab噬茵體抗體庫的構建及抗c.Met抗體的篩選、鑒定[J].南京醫科大學學報(自然科學版), 2008,28(6):697-701.

[6]Shen Y,Yang X,Dong N,et al.Generation and selection of immu?nized Fab phage display library against human B cell lymphoma[J]. Cell Res,2007,17(7):650-660.

[7]潘博,童貽剛.噬菌體抗體庫技術及其應用研究進展[J].生物技術通訊,2010,21(4):581-589.

[8]Rondot S,Koch J,Breitling F,et al.A helper phage to improve sin?gle-chain antibody presentation in phage display[J].Nat Biotech?nol,2001,19(1):75-78.

[9]Wind T,Stausb?l-Gr?n B,Kjaer S,et al.Retrieval of phage dis?played scFv fragments using direct bacterial elution[J].J Immunol Methods,1997,209(1):75-83.

[10]Corisdeo S,Wang B.Functional expression and display of an anti?body Fab fragment in Escherichia coli:study of vector designs and culture conditions[J].Protein Expr Purif,2004,34(2):270-279.