Wnt/β-Catenin信號通路與骨關節(jié)炎發(fā)病機制的研究*

王超華 張子博 朱 梅 劉 軍 任凱晶 盧 飚 李鳳翱 邱明才

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種退行性骨關節(jié)疾病，傳統(tǒng)觀點認為OA的發(fā)病與白細胞介素-1、腫瘤壞死因子等細胞因子及基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等蛋白酶類產(chǎn)生過多有關，但在臨床上應用抗炎藥物及蛋白酶抑制劑治療OA并沒有取得很好的療效。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路在OA的發(fā)病機制中起著重要的作用[1]。本研究旨在探討OA與Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路的關系，并進一步明確OA的發(fā)病機制，為OA的早期診斷和病情判斷提供參考，也為進一步治療和預防OA提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 研究組：按照2007年中華醫(yī)學會骨科分會公布的最新骨關節(jié)炎診治指南確定的膝關節(jié)炎診斷標準，選擇2009年10月—2010年7月于天津市天津醫(yī)院關節(jié)中心和天津市人民醫(yī)院關節(jié)外科行膝關節(jié)置換術的骨關節(jié)炎患者的關節(jié)軟骨標本，共42例，其中男6例，女36例，年齡50～77歲，平均（62.88±7.97）歲。研究組患者術前X線表現(xiàn)為關節(jié)間隙變窄、甚至消失，關節(jié)面硬化變形，關節(jié)邊緣骨贅形成，關節(jié)軟骨下囊性改變，關節(jié)失穩(wěn)。根據(jù)影像學資料，研究組中度病變5例，中度偏重病變20例，重度病變17例。術中大體病理可見關節(jié)軟骨組織磨損嚴重，甚至消失，以內(nèi)側(cè)為著，骨骼邊緣可見大量骨贅形成。對照組：取自天津醫(yī)科大學解剖學教研室無償提供的膝關節(jié)標本，根據(jù)肉眼觀察及病理評分結(jié)果排除退行性變、類風濕性關節(jié)炎及腫瘤性病變，共8例。

1.2 主要試劑 兔抗人β-catenin多克隆抗體（美國Cell Sig?naling公司）。0.4%胃蛋白酶消化液（北京中杉金橋生物技術有限公司）。兔抗人MMP-13多克隆抗體、5%正常山羊血清封閉液、生物素化山羊抗兔IgG、辣根酶標記鏈親和素（SABC）、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。Trizol、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Oligo（DT）、Buffer（美國Invitro?gen公司）。SYBR?Green Master Mix（日本Toyobo公司）。

1.3 方法

1.3.1 病理學觀察 根據(jù)情況每例患者及對照組分別取3～6個不同病變部位的膝關節(jié)軟骨標本，所取部位分別為脛骨內(nèi)側(cè)、脛骨外側(cè)、股骨內(nèi)側(cè)髁、股骨外側(cè)髁、股骨后髁、股骨前髁，軟骨已全部磨損的部位未取得標本。所取標本全部以10%中性福爾馬林溶液固定72 h，于30%甲酸混合液（30%甲酸+10%中性福爾馬林+60%雙蒸水）中脫鈣14 d，常規(guī)脫水，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。分別采用以下3種染色方法：HE染色、番紅O/固綠（SO/FG）染色和阿辛藍/橙黃G（AB/OG）染色，并根據(jù)改良的Mankin關節(jié)軟骨病理評分標準進行分級評定。結(jié)構(gòu)：正常0分，表層破壞1分，血管翳及表層破壞2分，淺層裂隙形成達移行層3分，裂隙局限性深達骨質(zhì)輻射層4分，深達骨質(zhì)鈣化層缺損負重區(qū)5分，全層軟骨缺損6分。細胞：正常0分，細胞過多、紊亂1分，細胞成簇2分，細胞少3分。SO/FG染色：正常0分，輕度失染1分，中度失染2分，重度失染3分，完全失染4分。潮線的完整性：完整0分，不完整、有血管通過1分。總分0～14分。正常（0～2分），輕度病變（3～7分），中度病變（8～11分），重度病變（12～14分）。

1.3.2 免疫組化 應用免疫組織化學卵白素-生物素復合技術（Avidin-Biotin complex method，ABC）分別檢測軟骨細胞中β-catenin及MMP-13的表達情況。

1.3.3 定量PCR 標本離體后，快速于無菌條件下分別留取與病理取材部位相一致處的關節(jié)軟骨組織，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ坷颊叻謩e選取2個標本，根據(jù)病理評分結(jié)果分為輕度病變組36例次和中度病變組48例次。分別提取其總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應用Real Time RT-PCR的方法，選用β2微球蛋白（beta-2-microglobulin，β2m）作為內(nèi)參，檢測骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，bmp-2）、Ⅹ型膠原（typeⅩcollagen，col-10）及mmp-13基因的表達水平。β2m上游5-TGAGTATGCCTGCCGTGTG-3，下游5-AAAGCAAGC AAGCAGAATTTG-3；bmp-2上游5-GTGGACTTCAGTGACG TGG-3，下游5-ACCAACGTCTGAACAATGG-3；col-10上游5-TGCTAGTATCCTTGAACTTGG-3，下游5-ACCTTGCT CTCCTCTTACTG-3；mmp-13上游5-ATGCCATTACCAGTC TCCG-3，下游5-TGCAGCATCAATACGGTTG-3，以上引物均由北京奧科生物技術有限公司合成。PCR擴增反應條件：95℃預變性5 min，94℃30 s，52℃～56℃30 s，72℃30 s，進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，β2m、bmp-2、col-10、mmp-13退火溫度分別為56℃、56℃、52℃、54℃。PCR擴增產(chǎn)物的測序也由上述公司完成。Real Time RT-PCR結(jié)果直接得到各個基因的Ct值，用同一標本目的基因的Ct值減去β2m基因的Ct值得出△Ct。用輕度病變組的△Ct值減去中度病變組的△Ct值得出△△Ct，通過2-△△Ct法計算出各目的基因在輕度病變組與中度病變組表達的差異。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，計數(shù)資料以例表示。輕度病變組△Ct值與中度病變組△Ct值的比較行兩獨立樣本資料t檢驗，免疫組化結(jié)果行χ2檢驗或確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果 對照組鏡下可見軟骨組織表面完整，結(jié)構(gòu)清晰，潮線完整，軟骨細胞呈極性排列。研究組可見軟骨表面不同程度破壞；軟骨細胞肥大增生，排列紊亂，細胞成簇，以至減少消失；潮線斷裂，可見新生血管通過并連通骨髓腔等改變，見圖1。改良的Mankin關節(jié)軟骨病理評分為對照組8例均正常；研究組輕度病變15例，中度病變27例。

2.2 免疫組化結(jié)果 β-catenin和MMP-13免疫組化陽性結(jié)果均顯示細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)有棕色顆粒樣沉著，陰性結(jié)果則無，見圖2。β-catenin免疫組化結(jié)果顯示正常組與輕度病變組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其余均無統(tǒng)計學意義；MMP-13免疫組化結(jié)果示正常組與輕、中度病變組比較差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），輕度病變組與中度病變組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.3 PCR結(jié)果 42例患者每例均取2個標本，輕度病變組36例，中度病變組48例。輕度病變組bmp-2、col-10、mmp-13的表達水平分別為中度病變組的3.01、2.89和4.04倍。2組各目的基因△Ct值比較差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見表2。

圖2 β-catenin、MMP-13免疫組化結(jié)果

表1 3組β-catenin、MMP-13免疫組化結(jié)果（例）

表2 2病變組基因表達水平比較 （△Ct，±s）

表2 2病變組基因表達水平比較 （△Ct，±s）

＊＊P＜0.01

組別輕度病變組中度病變組t n 36 48 2-△△CT bmp-2 2.18±2.08 3.77±1.60 3.965＊＊3.01 col-10 2.61±1.71 4.14±1.69 4.088＊＊2.89 mmp-13 0.68±1.99 2.69±1.94 4.647＊＊4.04

3 討論

OA是中老年人常見疾病，國內(nèi)40歲以上人群中X線診斷的OA總患病率達27.8%[2]。OA的發(fā)病與性別、年齡、遺傳、肥胖、炎癥、創(chuàng)傷等因素均有關，其病理生理改變?yōu)殛P節(jié)軟骨組織的合成與分解代謝失衡，導致軟骨細胞過度成熟、骨贅形成、關節(jié)軟骨破壞及關節(jié)間隙變窄。而這一失衡又是炎癥因子、細胞外基質(zhì)成分、基質(zhì)蛋白酶及多條信號轉(zhuǎn)導通路共同作用的結(jié)果。

有研究表明，MMPs和細胞因子在關節(jié)軟骨的破壞中起著重要作用[3]，其確切的發(fā)病機制目前尚不清楚。而最新的研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控著MMPs和BMP家族基因的表達水平[4]。Zhu等[5]通過小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，β-catenin的過度表達會使小鼠膝關節(jié)出現(xiàn)OA樣改變，并使軟骨細胞中mmp-9、mmp-13以及bmp-2基因的表達明顯增加。另有研究發(fā)現(xiàn)，對體外培養(yǎng)的兔關節(jié)軟骨應用Wnt-3A激活Wnt/β-catenin信號，能引起強烈的明膠酶的活性，并增加mmp-3和mmp-13基因的表達[6]。以上研究說明Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路在OA的發(fā)病機制中起著非常重要的作用。本研究中bmp-2、col-10和mmp-13均為軟骨細胞成熟的標志性基因，同時為Wnt/β-catenin信號傳導通路的下游基因。

BMP參與調(diào)控軟骨細胞的譜系分化、增殖、成熟、凋亡和礦化，可以增加下游效應因子run域因子（run domain factor-2，Runx 2）的表達，而后者能夠誘導增殖型軟骨細胞進一步分化為肥大型軟骨細胞。木瓜蛋白酶誘發(fā)的OA小鼠模型發(fā)現(xiàn)，滑膜與軟骨組織中BMP的含量明顯增加，BMP抑制劑可以逆轉(zhuǎn)OA骨贅的形成[7]。軟骨內(nèi)成骨過程終結(jié)后，bmp的過度表達則會誘導關節(jié)軟骨細胞肥大、分化、軟骨內(nèi)成骨、礦化以及骨贅形成。Blaney等[8]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠注射腺病毒Ad-BMP-2，使bmp-2 mRNA的表達增高，能促進小鼠膝關節(jié)形成骨贅，同時發(fā)現(xiàn)BMP-2的抑制劑能夠抑制其骨贅的形成。在機械性損傷所致的膝關節(jié)OA的軟骨細胞中，亦發(fā)現(xiàn)bmp-2的mRNA表達上調(diào)[9]。這些研究表明BMP-2在關節(jié)軟骨內(nèi)成骨，骨贅形成中起著重要的作用。最新的研究發(fā)現(xiàn)，OA患者外周血中BMPs和轉(zhuǎn)錄因子Runx 2的表達明顯增加，BMPs和轉(zhuǎn)錄因子Runx 2可以作為判斷疾病的活動性及其對治療反應的指標[10]。

COL-10以液態(tài)均相的形式分布于細胞外基質(zhì)中，通常存在于生長發(fā)育期的軟骨內(nèi)，由肥大的軟骨細胞合成，因此通常把COL-10作為軟骨細胞肥大的標志。骨生長停止后，COL-10也隨之消失。然而在病理狀態(tài)下，本應該終生維持未分化狀態(tài)的關節(jié)軟骨細胞肥大，并表達COL-10，導致關節(jié)軟骨細胞過度成熟、軟骨內(nèi)成骨、膠原降解、骨贅形成。與正常成人關節(jié)軟骨相比，COL-10可以在大部分OA的關節(jié)軟骨中檢測到，多分布于軟骨細胞團周圍，也可見于骨贅中[11]。Zhu等[5]發(fā)現(xiàn)β-catenin過度表達的小鼠，col-10的mRNA的表達量是對照組的3倍。這提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路對col-10的表達有調(diào)控作用。

MMP-13是目前已知的MMPs中最有效的Ⅱ型膠原降解酶。mmp-13基因的過度表達會造成關節(jié)軟骨的破壞。研究發(fā)現(xiàn)mmp-13基因高表達的轉(zhuǎn)基因小鼠，可出現(xiàn)類似OA樣的病理改變[12]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路在其中起著關鍵的作用[5,13]，β-catenin的過度表達能夠增加mmp-13基因的表達，導致軟骨基質(zhì)降解，關節(jié)軟骨破壞。低密度脂蛋白受體相關蛋白5（low-density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5）是Wnt/β-catenin通路的關鍵蛋白，其抑制劑能夠使OA軟骨細胞mmp-13 mRNA的表達量明顯下降[14]。

本研究結(jié)果顯示OA患者軟骨細胞中MMP-13蛋白的表達明顯增加，作為其上游信號通路β-catenin的表達也有所增加，但陽性率較低，可能與所取標本輕度病變例數(shù)較少及β-catenin增加是OA早期的標志有關。另外，通過Real Time RT-PCR的方法表明OA患者輕度病變組bmp-2、col-10和mmp-13基因的表達水平較中度病變組增加，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號傳導通路與OA早期的發(fā)生有著密切關系，β-catenin可以作為信號傳導通路上游表達的針對性治療靶點，但β-catenin對它們的具體作用機制和軟骨細胞特征性基因在整個疾病過程中的表達變化尚有待進一步的研究。

[1]Corr M.Wnt-beta-catenin signaling in the pathogenesis of osteoar?thritis[J].Nat Clin Pract Rheumatol,2008,4(10):550-556.

[2]王偉，王坤正，黨小謙，等.中老年人人群骨關節(jié)炎的流行病學研究[J].中國老年學雜志,2007,27(6):566-568.

[3]Burrage PS,Mix KS,Brinckerhoff CE.Matrix metalloproteinases:role in arthritis[J].Front Biosci,2006,11(6):529-543.

[4]Kawaguchi H.Regulation of osteoarthritis development by Wnt-be?ta-catenin signaling through the endochondral ossification process [J].J Bone Miner Res,2009,24(1):8-11.

[5]Zhu M,Tang D,Wu Q,et al.Activation of beta-catenin signaling in ar?ticular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice[J].J Bone Miner Res, 2009,24(1):12-21.

[6]Yuasa T,Otani T,Koike T,et al.Wnt/beta-catenin signaling stimu?lates matrix catabolic genes and activity in articular chondrocytes: its possible role in joint degeneration[J].Lab Invest,2008,88(3): 264-274.

[7]Scharstuhl A,Vitters EL,Van der Kraan PM,et al.Reduction of os?teophyte formation and synovial thickening by adenoviral overex?pression of transforming growth factor beta/bone morphogenetic pro?tein inhibitors during experimental osteoarthritis[J].Arthritis Rheum, 2003,48(12):3442-3451.

[8]Blaney Davidson EN,Vitters EL,van Beuningen HM,et al.Resem?blance of osteophytes in experimental osteoarthritis to transforming growth factor beta-induced osteophytes:limited role of bone mor?phogenetic protein in early osteoarthritic osteophyte formation[J]. Arthritis Rheum,2007,56(12):4065-4073.

[9]Dell'Accio F,De Bari C,El Tawil NM，et al.Activation of WNT and BMP signaling in adult human articular cartilage following mechani?cal injury[J].Arthritis Res Ther,2006,8(5):R139.

[10]Grcevic D,Jajic Z,Kovacic N,et al.Peripheral blood expression profiles of bone morphogenetic proteins,tumor necrosis factor-su?perfamily molecules,and transcription factor Runx2 could be used as markers of the form of arthritis,disease activity,and therapeutic responsiveness[J].J Rheumatol,2010,37(2):246-256.

[11]Goldring MB,Goldring SR.Articular cartilage and subchondral bone in the pathogenesis of osteoarthritis[J].Ann N Y Acad Sci,2010, 1192(3):230-237.

[12]Neuhold LA,Killar L,Zhao W,et al.Postnatal expression in hyaline cartilage of constitutively active human collagenase-3(MMP-13)in?duces osteoarthritis in mice[J].J Clin Invest,2001,107(1):35-44.

[13]Nakashima A,Tamura M.Regulation of matrix metalloproteinase-13 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 gene expression by WNT3A and bone morphogenetic protein-2 in osteoblastic dif?ferentiation[J].Front Biosci,2006,11(5):1667-1678.

[14]Papathanasiou I,Malizos KN,Tsezou A.Low-density lipoprotein re?ceptor-related protein 5(LRP5)expression in human osteoarthritic chondrocytes[J].J Orthop Res,2010,28(3):348-353.