秸稈降解菌株的誘變選育及發(fā)酵條件的研究

黃曉梅，楊 謙，陳秀玲，范金霞，徐 杰

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)系，150001哈爾濱，yangq@hit.edu.cn;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，150030哈爾濱)

采用微生物降解將纖維素轉(zhuǎn)化成乙醇、單細(xì)胞蛋白、有機(jī)酸等已成為纖維素資源再生利用研究的熱點(diǎn).自然界當(dāng)中能分解纖維素的生物主要是真菌類及部分細(xì)菌，以木霉、曲霉、青霉的能力最突出［1-3］，綠色木霉具有較強(qiáng)的分解天然纖維素的能力，目前被認(rèn)為是最有應(yīng)用前景的纖維素酶生產(chǎn)菌之一［4］，但霉菌纖維素酶活力較低，一直是阻礙其大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的瓶頸問題［5］.目前的解決方法一是通過菌種的篩選、選育、基因工程［6］和細(xì)胞工程等手段提高纖維素酶的產(chǎn)量和活力，二是改變天然纖維素的結(jié)構(gòu)，從而提高其對(duì)酶的敏感性.其中菌種選育是獲得高效纖維素分解菌株的關(guān)鍵，也是纖維素酶生產(chǎn)的基礎(chǔ).紫外線誘變和化學(xué)誘變是最簡單、方便又有效的誘變選育高產(chǎn)菌的方法，國內(nèi)外科研工作者一直都在進(jìn)行這方面研究，但目前還缺乏高效降解秸稈生產(chǎn)纖維素酶的菌株.因此，通過紫外線和硫酸二乙酯的復(fù)合誘變方法，篩選纖維素酶活高的綠色木霉變異株，并對(duì)其利用秸稈發(fā)酵條件進(jìn)行研究，為利用秸稈工業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶和應(yīng)用提供依據(jù).

1 試驗(yàn)

1.1 菌種

綠色木霉(T.viride)CICC 13038購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心.

1.2 培養(yǎng)基

斜面和平板培養(yǎng)基:馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA).

篩選培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉7.5～10 g/L，(NH4)2SO41.4 g/L，脲 0.3 g/L，KH2PO42.0 g/ L，CaCl20.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，蛋白胨0.5～1.0 g/L，吐溫80 1.0～2.0 g/L，F(xiàn)eSO4· 7H2O 5.0mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4mg/L，MnSO4· H2O 1.6 mg/L，CoCl22.0 mg/L，pH 5～6［7］，剛果紅0.2 g/L，瓊脂20 g/L.

種子液培養(yǎng)基:馬鈴薯液體培養(yǎng)基(PD).

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基:蛋白胨3 g/L，硫氨2 g/L，酵母膏0.5 g/L，KH2PO44 g/L，CaCl2·2H2O 0.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，吐溫 80 0.2 g/L，碳源23.5 g/L［8］，根據(jù)研究需要，變動(dòng)培養(yǎng)基的成分.

1.3 誘變和篩選

1.3.1 孢子懸浮液制備

取活化培養(yǎng)4 d的綠色木霉平板，用無菌水沖洗下孢子，通過3層無菌擦鏡紙過濾至盛有玻璃珠的無菌三角瓶中，振蕩15 min，使孢子分散，稀釋成為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液.

1.3.2 復(fù)合誘變

硫酸二乙酯處理:在制備好的孢懸液中分別加入體積分?jǐn)?shù)為1%～2%的硫酸二乙酯混勻，于30℃條件下黑暗振蕩處理10～30 min，取50 μL孢懸液均勻涂布于PDA平板上.

紫外線照射:在暗室的無菌工作臺(tái)上用30 W的紫外燈，距離30 cm照射涂布孢子的平板1～3 min，置于30℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)5 d.并且實(shí)驗(yàn)設(shè)有硫酸二乙酯和紫外線單獨(dú)處理的單因素誘變處理.

1.4 初篩和復(fù)篩

挑取單菌落于剛果紅篩選培養(yǎng)基上初篩.選取纖維素透明圈與菌落直徑比值大的菌落，進(jìn)行3次初篩，菌株傳代10代，以備進(jìn)一步復(fù)篩.

初篩后的菌株按培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)的5%接入1×106個(gè)/mL的孢懸液于液體篩選培養(yǎng)基，進(jìn)行復(fù)篩.整個(gè)培養(yǎng)期測定羧甲基纖維素酶活(CMCase)、濾紙酶活(FPase)、β-葡萄糖苷酶活(βGase).

1.5 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)

種子液制備:以PD為培養(yǎng)基，按培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)1%接種1×106個(gè)/mL的孢懸液，在30℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h.

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng):按產(chǎn)酶培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)的10%接種種子液，在30℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣測定發(fā)酵液中纖維素酶活，每個(gè)處理均重復(fù)3次.

1.6 纖維素酶活力測定

纖維素粗酶液制備:發(fā)酵液經(jīng)5 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液.

纖維素酶活的測定:CMCase、FPase、βGase測定方法參照文獻(xiàn)［9］，0.5 mL粗酶液加入底物1.5 mL，反應(yīng)后加入2 mL DNS，煮沸10 min，測定540 nm的吸光值.測定時(shí)間為5 d.

酶活單位:用國際單位(U)，即在實(shí)驗(yàn)條件下，每小時(shí)產(chǎn)生1 mg葡萄糖為1個(gè)酶活單位［10］.

1.7 發(fā)酵條件優(yōu)化

1)碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響.選擇10種碳源，組成24種組合(見表2)，兩種碳源以1∶1比例混合，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.35%加入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，每個(gè)處理均重復(fù)3次，下同.

2)碳源比例對(duì)產(chǎn)酶的影響.選擇最優(yōu)組合，兩種碳源按7∶0，6∶1，5∶2，4∶3，3∶4，2∶5，1∶6和0∶7比例混合，加入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中.

3)氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響.根據(jù)得到的最佳碳源比例，選擇11種氮源(見表3)，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%對(duì)氮源種類進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳無機(jī)氮源和有機(jī)氮源.

4)氮源比例對(duì)產(chǎn)酶的影響.按質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%將無機(jī)和有機(jī)氮源按6∶0，5∶1，4∶2，3∶3，2∶4，1∶5和0∶6比例加入培養(yǎng)基中，研究產(chǎn)酶的變化，確定最佳氮源比例.

5)碳氮比例對(duì)產(chǎn)酶的試驗(yàn).在碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.35%情況下，碳氮比例為9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1，進(jìn)行最佳產(chǎn)酶碳氮比優(yōu)化.

6)碳氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)產(chǎn)酶的影響.在碳氮比例確定的情況下，比較碳氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.33%、2%、2.67%、3.33%、4%、4.67%、5.33%、6%、6.67%、7.33%時(shí)產(chǎn)酶的變化，得到最佳產(chǎn)酶的碳氮質(zhì)量分?jǐn)?shù).

7)起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響.用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液配置不同pH值(3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、5.8、6.2、6.4、6.8、7.2、7.6)的培養(yǎng)液，作為起始培養(yǎng)pH值，確定產(chǎn)酶最佳的酸堿條件.

8)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響.將接種的液體培養(yǎng)基置于20、24、26、28、30、32、34和38℃環(huán)境中培養(yǎng)，比較溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響.

9)發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的試驗(yàn).從發(fā)酵的第2天開始，每隔24 h測定一次酶活，直至第9天結(jié)束.比較不同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)酶的變化.

2 結(jié)果與分析

2.1 突變株的篩選

剛果紅纖維素平板透明圈篩選法可用于初步判定纖維素酶活性高低，產(chǎn)酶越多，透明圈越大，產(chǎn)酶越快，透明圈出現(xiàn)越早［8］.從誘變后培養(yǎng)5 d的平板上挑取430個(gè)單菌落，經(jīng)過3次剛果紅纖維素平板透明圈法初篩選出25個(gè)菌株.

透明圈大小直接反映了酶活性高低，但不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力，因此，必須進(jìn)行液體發(fā)酵復(fù)篩.通過搖瓶產(chǎn)酶培養(yǎng)，結(jié)果表明:整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)不同菌株酶的活性有較大差異，酶活的高峰也不盡相同.經(jīng)過差異顯著性分析(F=93.24，df=6，P＜0.01)(見表1)，有6個(gè)菌株的纖維素酶活顯著高于原始出發(fā)菌株的酶活，其中，h157菌株產(chǎn)酶最佳，CMCase比出發(fā)菌株提高72.53%、FPase提 高 42.18%、βGase提 高85.15%.通過誘變育出6株穩(wěn)定、高產(chǎn)纖維素酶的綠色木霉突變菌株，均為復(fù)合誘變選育得到的.達(dá)到了菌種改良的目的.

表1 復(fù)篩菌株與出發(fā)菌株纖維素酶活力比較

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

纖維素酶是誘導(dǎo)酶，不同的底物產(chǎn)纖維素酶活性不同.天然纖維中含有大量的纖維素，對(duì)纖維素酶的產(chǎn)生有一定誘導(dǎo)作用.以麩皮、稻草、玉米桿為主要底物，在24種碳源組合中(表2)，纖維素酶活差異較大，稻草、玉米稈、麩皮纖維性碳源的組合，生產(chǎn)纖維素酶效果明顯優(yōu)于含單糖、二糖等可溶性碳源組合.其中稻草/玉米稈的CMCase、FPase和βGase最高，其次是麩皮/玉米稈、麩皮/稻草，其他組合酶活較低.原因可能一是纖維性碳源組合在測定酶活時(shí)正是產(chǎn)酶高峰期，二是麩皮、稻草、玉米桿組成成分復(fù)雜，含有適合菌體生長的營養(yǎng)成分及有較豐富的適合菌株產(chǎn)酶的生長因子.只有碳源既滿足菌體生長需要也能滿足其產(chǎn)酶需要時(shí)才能產(chǎn)生較多的纖維素酶.通過碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響研究，確定稻草/玉米稈組合是綠色木霉h157最適合產(chǎn)酶的碳源.

表2 碳源對(duì)綠色木霉h157產(chǎn)纖維素酶的影響U·mL-1

2.2.2 碳源比例對(duì)產(chǎn)酶的影響

碳源除供菌體生長外，還是微生物發(fā)酵過程中的誘導(dǎo)物和分解底物.麩皮、稻草、玉米稈組成成分復(fù)雜，促進(jìn)菌體生長和誘導(dǎo)菌體產(chǎn)酶的能力不同，因此，碳源的比例是產(chǎn)酶的關(guān)鍵因素.由圖1可以看出，不同碳源比例CMCase、FPase變化較大，βGase變化較小.稻草和玉米稈比例為6∶1時(shí)CMCase最高，F(xiàn)Pase在6∶1至4∶3時(shí)變化不大，以后呈下降趨勢.βGase高峰期出現(xiàn)在5∶2時(shí)，但在6∶1至5∶2時(shí)變化不大，以后緩慢下降，綜合考慮，對(duì)于h157菌株最佳產(chǎn)酶的稻草和玉米稈比例為6∶1.

圖1 碳源比例對(duì)綠色木霉h157菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

2.2.3 氮源種類對(duì)產(chǎn)酶的影響

氮源的種類和性質(zhì)也是影響酶活力和產(chǎn)率的重要因素，氮源通過影響酶蛋白前體的形成，來調(diào)控酶的合成［11］.本實(shí)驗(yàn)采用的11種無機(jī)和有機(jī)氮對(duì)h157產(chǎn)酶的影響結(jié)果如表3所示，不同的氮源對(duì)酶活影響較大，氨態(tài)氮比硝態(tài)氮有利于綠色木霉產(chǎn)生纖維素酶，可能與其代謝類型有關(guān).其中，NH4Cl比(NH4)2SO4的CMCase略高，但FPase和βGase則(NH4)2SO4比NH4Cl高，在研究的有機(jī)氮中蛋白胨和豆餅粉的 CMCase、FPase和βGase較高，但豆餅粉比蛋白胨價(jià)格低廉，綜合考慮，無機(jī)氮源和有機(jī)氮源分別選擇(NH4)2SO4和豆餅粉.

表3 氮源對(duì)綠色木霉h157菌株產(chǎn)纖維素酶的影響U·mL-1

2.2.4 無機(jī)氮和有機(jī)氮比例對(duì)產(chǎn)酶的影響

無機(jī)氮和有機(jī)氮比例是影響菌體生長和產(chǎn)酶的關(guān)鍵因素之一，兩種氮源的比例對(duì)產(chǎn)酶的影響作用見圖2，以無機(jī)氮源(NH4)2SO4為單獨(dú)氮源比以有機(jī)氮源豆餅粉為單獨(dú)氮源時(shí)酶活高，隨著(NH4)2SO4與豆餅粉比例的增加纖維素酶活力先上升后下降，當(dāng)(NH4)2SO4與蛋白胨比例為4∶2時(shí)，βGase達(dá)到高峰，(NH4)2SO4與豆餅粉比例為3∶3時(shí)，CMCase和FPase達(dá)到最高峰，綜合考慮，(NH4)2SO4與豆餅粉比例為3∶3有利于CMCase、FPase和βGase的提高.

圖2 氮源比例對(duì)綠色木霉h157菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

2.2.5 碳氮比例對(duì)產(chǎn)酶的影響

碳氮比例是影響菌體的生長和酶合成的重要因素之一，碳氮比例對(duì)綠色木霉產(chǎn)酶的影響作用見圖3，隨著碳氮比的增加纖維素酶活力先上升后下降，碳氮比例在8∶1和7∶1時(shí)，CMCase、FPase和βGase的變化幅度不大，碳氮比為8∶1時(shí)FPase最高，比例為7∶1時(shí)CMCase和βGase最高，綜合考慮碳氮比例為7∶1有利于提高h(yuǎn)157的酶活力.

圖3 碳氮比例對(duì)綠色木霉h157菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

2.2.6 碳氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)產(chǎn)酶的影響

碳氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)不但影響菌體生長和產(chǎn)酶，更影響培養(yǎng)液中含氧量.碳氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)產(chǎn)酶的影響作用見圖4，隨著碳氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加纖維素酶活力先上升后下降，碳氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3.3%時(shí)，CMCase和βGase最高，F(xiàn)Pase較高，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到4.0%時(shí)，F(xiàn)Pase最高，但CMCase和βGase下降幅度較大，因此，發(fā)酵時(shí)選擇碳氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.3%有利于產(chǎn)酶.

圖4 碳氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)綠色木霉h157菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

2.2.7 pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

微生物在最適pH值條件下，生長迅速，代謝旺盛，發(fā)育良好.pH值過高或過低，微生物均不能很好地生長發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡［12］.同時(shí)，pH值還影響酶的穩(wěn)定性和活性.pH值對(duì)h157菌株產(chǎn)纖維素酶的影響作用見圖5，pH值在4.8～5.8 CMCase變化不大，pH值在4.8～5.2 FPase最高，pH值在4.8～5.6 βGase變化不大.綜合考慮，pH為5.2時(shí)有利于產(chǎn)纖維素酶.

圖5 pH值對(duì)綠色木霉h157菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

2.2.8 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

溫度是影響微生物機(jī)體最重要的因素之一.不但影響菌體的生長，還影響產(chǎn)酶的量.從圖6中可以看出，CMCase、βGase和 FPase在28℃時(shí)達(dá)到最高，30℃時(shí)CMCase和FPase緩慢下降，而βGase快速下降.所以，28℃是最適合綠色木霉h157產(chǎn)酶的培養(yǎng)溫度.

2.2.9 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

在培養(yǎng)過程中酶活變化如圖7所示，隨著時(shí)間的推移，纖維素酶活由低到高，然后又下降，CMCase、βGase在4 d時(shí)達(dá)到最高值，F(xiàn)Pase在5 d時(shí)達(dá)到最高值，4～5 d是產(chǎn)酶的高峰期，為縮短生產(chǎn)周期，最佳收獲酶的時(shí)間為4 d.

圖6 培養(yǎng)溫度對(duì)綠色木霉h157菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)綠色木霉h157菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

3 討論

隨著分子生物學(xué)方法的不斷進(jìn)步，近年來出現(xiàn)了一些新的菌種選育方法［13-14］，但誘變育種作為一種簡便易行而且快速的選育方法，至今仍被廣泛應(yīng)用.目前工業(yè)中的優(yōu)良高產(chǎn)菌株絕大部分都是以這種方法獲得.特別是對(duì)遺傳背景不很清楚的微生物，誘變育種更是必不可少.單一誘變劑只誘變菌株的DNA某一個(gè)或是幾個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行突變，誘變出來的高產(chǎn)菌株很容易恢復(fù)突變，長期使用誘變劑還會(huì)產(chǎn)生誘變劑“疲勞效應(yīng)”、菌種生長周期延長、孢子量減少、代謝減慢等現(xiàn)象.而復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng)，正突變菌株的遺傳比較穩(wěn)定，誘變效果明顯.本研究采用紫外線和硫酸二乙酯對(duì)綠色木霉進(jìn)行誘變，獲得的6株高產(chǎn)菌種均為復(fù)合誘變菌株，與Mahesh等［15］的研究結(jié)果相似.由于纖維素酶為一種分泌型誘導(dǎo)酶，碳源影響其纖維素酶的分泌.

4 結(jié)論

1)采用復(fù)合誘變方法處理綠色木霉(T. viride)菌株，得到6株穩(wěn)定高產(chǎn)纖維素酶的綠色木霉(T.viride)突變株.并對(duì)其液體發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，為利用秸稈工業(yè)化液體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶提供了菌株和工藝參數(shù).

2)綠色木霉h157產(chǎn)纖維素酶的最適宜碳源是稻草和玉米稈，最佳比例為6∶1，最佳氮源為(NH4)2SO4和豆餅粉，最佳比例為1∶1，最適碳氮比為7∶1，碳氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.3%，產(chǎn)酶適宜pH為5.2，最佳產(chǎn)酶溫度為28℃，最佳產(chǎn)酶時(shí)間為4 d.

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