不同類型栽培半夏同工酶分析

韓 鳳，韋 波，封孝蘭，全 健，曹厚強，梁正杰

（重慶市藥物種植研究所，重慶 408435）

半夏[Pinellia ternata（Thunb.）Breit]是我國重要的傳統中藥材，也是重要的出口產品。具燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結之功效，主治痰多咳嗽、嘔吐反胃、胸脘痞氣等癥。廣泛分布于我國長江流域以及東北、華北等地區[1]。生長于不同環境或同一生態環境的不同居群，甚至同一居群的不同個體間，半夏的各種器官(包括根、球莖、珠芽、葉片、葉柄等)在形態上都存在著豐富的變異類型，其中以葉、球莖和珠芽的變異更明顯[2-5]，具體表現為種內居群間出現不同程度的分化現象，這必將影響到藥材質量的穩定。生產上推廣種植的半夏均是一個復雜的混合群體，因此選育高產、優質和多抗的半夏新品系已成為育種工作者的當務之急。為此，本研究以同一生長期的栽培半夏葉片為材料，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳技術對其過氧化物同工酶（POD）、酯酶同工酶（EST）的檢測和分析，從分子水平探討栽培半夏的種內分化情況，為半夏的資源收集和優良品系的選育提供更多的遺傳背景資料。

1 材料和方法

1.1 供試材料及設備

于5月上旬重慶市藥物種植研究所標本園采摘栽培的半夏。根據葉片的形狀分為竹葉葉型（Ⅰ）、橢圓葉型（Ⅱ）、芍藥葉型（Ⅲ）、心葉型（Ⅳ）。電泳設備為DYCZ-28A型電泳槽及DYY-12型電腦三恒多用電泳儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 聚丙烯酰胺凝膠的制備 按胡能書等[6]的方法制備聚丙烯酰胺凝膠，每板12個點樣槽。分離膠濃度7.5%，濃縮膠濃度3%。

1.2.2 酶液的制備 將半夏的葉片用蒸餾水沖洗干凈，用吸水紙吸干水分后，各稱取2 g加Tris-HCl（pH值8.2）提取緩沖液5mL，冰浴中充分研磨成勻漿，低溫下3 500 r/min離心20 min，上清液為酶的粗提取液，加少量40%蔗糖混合均勻，置冰箱中冷藏備用。

1.2.3 電 泳 用50μL微量進樣器吸取酶液點在樣品槽中，加入2滴溴酚藍指示電泳前沿。在4℃冰箱中恒壓電泳，起始電壓為112 V，待示蹤指示劑進入分離膠后增大到210 V，待溴酚藍移至距膠前沿1 cm處停止電泳，電泳全過程為4 h。

1.2.4 染 色 過氧化物酶同工酶用醋酸-聯苯胺法染色；酯酶用乙酸-α-萘酯、乙酸-β-萘酯及固藍B鹽染色，待酶帶清晰用蒸餾水漂洗后，置7.5%冰醋酸中固定。選取酶帶清晰重復性好的膠版攝影，根據酶譜中酶帶的遷移率大小和酶帶的強弱繪制酶譜模式圖。

2 結果與分析

2.1 過氧化物酶（POD）同工酶

4個不同葉型半夏過氧化物酶（POD）同工酶電泳模式圖見圖1。由圖可見，供試的半夏過氧化物酶同工酶酶譜差異顯著，其具體表現為遷移率、酶帶數和酶帶強弱顯著不同，呈現出豐富的多態性。圖上共顯示出13條酶帶，酶帶的Rf值在0.032～0.836之間，其中有1條譜帶為所有供試材料共有，即Rf值為0.688的譜帶。由于遷移率的差異，整個酶譜從負極到正極可劃分為2個區域，即慢帶區（A區）和快區（B區），A區＜0.2，B區＞0.5。A區有6條酶帶，其中有2條為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3種類型所共有，Ⅰ類型比Ⅱ、Ⅲ類型多Rf=0.106這一條。Ⅳ類型有3條酶帶Rf分別為0.032、0.053、0.089，都不同于其他3種類型。

圖1 4個類型半夏過氧化物酶（POD）同工酶電泳模式圖

2.2 酯酶（EST）同工酶

4個不同葉型半夏酯酶（EST）同工酶電泳模式圖見圖2。供試材料共顯示出9條譜帶，Rf值在0.032 6～0.717 4之間，其中有3條譜帶是共有譜帶，即 Rf分別為 0.032 6、0.076 0、0.673 9，說明它們都有較為相似的遺傳背景。Ⅲ、Ⅳ類型譜帶最少，只有4條；Ⅱ類型有5條譜帶；Ⅰ類型最多，有7條。而Ⅱ、Ⅲ類型分離酶帶有4條完全一致，除Ⅱ類型比Ⅲ類型多1條外，酶帶顏色深淺和遷移率均一致，說明這兩種類型具有共同起源的基因表現，而不同的譜帶說明各自在特定的生長環境或不同進化過程中已經發生了趨異分化，可將二者歸為一類型加以選育。試驗結果表明，所取4種不同葉型半夏的樣品，經多次重復測試分析，其總趨勢是一致的，可劃分為3組，即Ⅰ為一類型，Ⅱ、Ⅲ為同一類型，Ⅳ為一類型。

圖2 4個類型酯酶（EST）同工酶電泳模式圖

3 結論與討論

（1）細胞學研究結果已證明半夏是一個復合多倍體，個體間的差異從本試驗的2種同工酶酶譜分析結果也得到了證實。共有的特征性譜帶可認為是相互之間具有共同起源的基因表現，而不同的譜帶說明各自在特定的生長環境或不同的進化過程中已發生了趨異分化。

（2）過氧化物、酯酶同工酶電泳數據分析表明半夏不同類型之間既有共同酶帶，又有各自的特征酶帶，酶譜反映了半夏不同類型之間的相互聯系與區別。試驗證明在同一栽培條件下，不同個體葉片的過氧化物酶、酯酶同工酶，除少數特征譜帶外，多數譜帶的出現頻率有較大差異，指標在半夏不同類型之間具有特異性，且與半夏在形態學上的差異性是一致的，可用作分類鑒定依據之一。

（3）半夏不同類型之間譜帶的差異表現在特征酶帶顏色深淺不同，寬度不同，遷移率也不同，這一方面說明了這些材料間存在著共同的遺傳基礎，或者說，它們之間有不同程度的親緣關系；另一方面也反映了各材料間存在著不同程度的遺傳差異。

[1] 中國醫學科學院藥物研究所.中藥志（第2冊第2版）[M].北京：人民衛生出版社.1993.

[2] 陳 宏.半夏研究進展[J].現代農業科技，2010，（5）：80-81.

[3] 裴建文，孫新榮，王 鵬，等.施肥對半夏總蛋白質含量的影響[J].廣東農業科學，2010，（2）：79-83.

[4] 程霞英，陶曉曄.三葉半夏組織培養研究 [J].安徽農業科學，2010，（3）：1643-1645.

[5] 郭巧生，沈文飚，劉 麗，等.半夏種內不同居群酯酶和超氧化物歧化酶同工酶酶譜特征分析 [J].植物資源與環境學報，2001，10（2）：42-46.

[6] 胡能書，萬賢國.同工酶技術及其應用[M].長沙：湖南科技出版社，1985.74-75.