衣原體MOMP蛋白生物多態性及細胞表位分析

李宜儒，姚衛鋒，盛彩虹，李玲杰，尤 聰，展小飛，劉原君，齊蔓莉，劉全忠

（天津醫科大學總醫院皮膚科，天津300052）

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis,Ct）泌尿生殖道感染是世界范圍內嚴重危害公眾健康的一種細菌感染性疾病。Ct的生殖道感染常引起女性盆腔炎、宮頸炎等，常引起男性尿道炎、睪丸炎和前列腺炎等。由于無癥狀性衣原體感染的普遍存在，致使該疾病不易被發現而得不到及時治療，導致Ct在宿主體內持續存在并引起不孕、異位妊娠等嚴重并發癥。目前Ct抗藥性日益嚴重，且實驗室藥敏結果仍無法指導臨床實踐，故闡明Ct致病機制，尋找免疫優勢抗原研制疫苗，是預防、控制Ct感染的關鍵。當今公認的沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、肺炎衣原體和反芻動物衣原體是引起人類和動物一系列疾病的病原，所有這些衣原體都有一個相同的成分：主要外膜蛋白(MOMP)。MOMP暴露于衣原體膜表面，約占外膜蛋白的60%[1]，在維持衣原體結構完整性中起重要作用。它的抗原決定簇較為復雜，包括種、亞種、亞群、血清型等抗原決定簇。MOMP是目前研究最多的Ct抗原，也被認為是Ct亞單位疫苗最佳的候選抗原[2-3]，已有報道認為，從MOMP的多變區獲得的一段多肽制備的亞單位疫苗可刺激機體產生特異性中和抗體和顯著的DTH反應[4]，但對能否明顯抑制衣原體的生長繁殖結果不一。本文旨在通過生物信息學分析，預測MOMP蛋白的二級結構及其優勢表位，確定該蛋白家族多態性的決定區及保守區。

1 材料與方法

1.2 蛋白二級結構預測 采用Gamier-Robson方法、Chou-Fasman方法和Karplus-Schulz方法預測蛋白二級結構。B細胞表位預測以7個氨基酸殘基為一組，分別按Kyte-Doolittle、Emini和Jameson-Wolf方案預測其親水性、表位可能性和抗原性指數。以ClustalX軟件序列比對分析其多變區[5]。

2 結果與分析

2.1 衣原體MOMP蛋白多序列比對 沙眼衣原體各血清型A/B/C/D/E/F/H/L1/L3比對后，發現序列多變區集中位于N端第90-107、163-183、328-344（圖1）。

沙眼衣原體E型、肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體MOMP蛋白序列比對，以E型序列為基準校對后，多變區為：80-107、165-178、249-264、332-346（圖2）。

圖1 沙眼衣原體各型MOMP蛋白序列比對Fig 1 The protein sequence regment of Chlamydia trachomatis of different serotypes

圖2 衣原體MOMP蛋白序列比對Fig 2 The regment of Chlamydia MOMP protein

2.2 沙眼衣原體E型株MOMP蛋白二級結構及B細胞抗原表位分析 生物信息學方法預測沙眼衣原體E型株MOMP蛋白的二級結構和抗原表位（圖3）發現，多個強表位位于：100-118，216-225，232-245，256-270，300-313，348-356。弱表位為：27-33，45-54，150-158，377-390，364-371。

圖3 沙眼衣原體E型株MOMP蛋白二級結構及B細胞抗原表位預測Fig 3 The prediction of the secondary structure and B cell epitope of MOMP protein of Chlamydia E

3 討論

沙眼衣原體是目前性傳播疾病研究的熱點。MOMP蛋白的抗原決定簇較為復雜,包括種、亞種、亞群、血清型等抗原決定簇。直接比較DNA序列，因密碼子通用性將獲得龐大的冗余信息，因而我們選擇了多肽序列分析。

通過多肽的多序列比對，可以將需要分析的區域大大縮短。比對結果顯示，沙眼衣原體各血清型多肽序列只在3個區域存在明顯多態性---N端第90-107、163-183、328-344區域。而不同衣原體序列比對結果示存在明顯多態性的區域為：N端第80-107、165-178、249-264、332-346。N端第90-107、163-183、328-344區域重疊的存在顯示該區域中有賦予該蛋白特異性的抗原表位并提示其決定了蛋白功能的差異，對衣原體分類有重要意義。同時，在以下對沙眼衣原體E型株的表位預測中，也證明了這一結果（圖3豎線區域）。對各序列總體而言，其序列殘基組成及排序相似度較高，說明蛋白結構有很高的相似度，從進化角度提示了MOMP有重要功能，其性質保守。

蛋白的結構和其功能密切聯系，現有實驗方法分析蛋白質結構迫于成本和技術還難有突破，因而也制約了對蛋白功能的認識，這是目前分子生物學研究中迫切需要解決的問題[6-7]。試圖直接從氨基酸序列推斷某一蛋白質的功能位點或預測其三維結構（包括二級和三級結構）是生物信息學的重要課題之一。蛋白質的二級結構是蛋白質復雜的空間構象的基礎。其形成幾乎全是由于肽鏈骨架中羰基上的氧原子和亞胺基上的氫原子之間的氫鍵所維系。其他的作用力，例如范德華力等，也有一定的貢獻[8]。目前的研究通過建立并完善作用力計算模型，對二級結構預測的精度也日益提高。

以Garnier-Robson法和Chou-Fasman法，都預測到MOMP蛋白的β折疊比α螺旋的數量多，可以認為蛋白的二級結構以β折疊為主；并且預測到MOMP蛋白有頻繁出現的轉角和無規則卷曲區域。因而我們認為該蛋白有較為復雜的空間結構，存在眾多的轉角區域可作為候選的B細胞抗原表位。

為獲得對各種衣原體都有作用的抗體，我們以沙眼衣原體E型株MOMP蛋白相對保守的抗原區域為目標，著重預測了該區域的二級結構和抗原表位，并作出注釋（圖3）。α螺旋、β折疊常位于蛋白質內部，因而不易形成抗原表位；而轉角及無規則卷曲多位于蛋白質分子表面，形成抗原表位的可能性較大，從而構成蛋白質的功能區域；并且轉角中含有相當比例的極性殘基，因而轉角及其附近比整個分子有更大的親水性[13]，利于與抗體嵌合，而且糖基化以及磷酸化等轉譯后的加工通常發生在β轉角或其附近區域。還發現轉角這種二級結構在進化中保守性比氨基酸序列的保守性強，這提示β轉角對蛋白質的結構、功能和進化都有重要意義[9-12]。同時還必須考慮抗原指數--抗原指數與形成抗原表位的可能性成正比。抗原指數分析結果表明序列約有19個集中的抗原表位區域且指數值較高，在其中篩選活性較強并能表現其活力的區域還需要綜合分析其結構、親水性及柔韌性等因素。

平衡各因素考慮，筆者認為：沙眼衣原體E型株 MOMP蛋白的強表位位于：100-118，216-225，232-245，256-270，300-313，348-356。弱表位為：27-33，45-54，150-158，377-390，364-371。

實驗發現，B細胞缺陷鼠不僅缺乏抗體反應，而且不能引起Ct肺感染后的有效的遲發性超敏反應; B細胞缺陷鼠感染后脾細胞不產生Th1相關的細胞因子(INF-γ)。這些發現表明，B細胞在宿主抵抗原發和繼發Ct感染中有重要作用，而且對啟動T細胞反應也是必需的。以往的研究表明，人類生殖道Ct再次感染的持續時間較初次感染縮短，這提示Ct感染可誘生部分的保護性免疫應答。目前已知Ct感染能誘發機體免疫系統產生抗體，包括IgG、IgA、IgE等。由于Ct感染發生在生殖道黏膜，因此生殖道局部的IgA的免疫保護作用及其機制倍受關注。有研究報道，針對MOMP的黏膜分泌的IgA抗體有一定的保護性作用，Ct特異性IgA能夠通過阻斷Ct對黏膜上皮細胞的粘附和Ct的集落形成從而阻斷其進一步對宿主細胞的感染，這提示能夠誘導產生高水平黏膜局部IgA的疫苗可預防Ct感染。Ct外膜的主要外膜蛋白（MOMP）是誘導體液免疫的重要抗原，Ct表位決定了保護性抗體的產生，并且作為抗體的特異性靶抗原。一旦表位改變，則中和作用不復存在，所以Ct感染很難誘導出廣譜長效的體液免疫效應。因而我們通過序列分析確認了衣原體MOMP蛋白的保守序列，并分析了該序列的潛在抗原表位，為后續的研究奠定基礎。

［1］ Danilition SL,Maclean IW,Peeling R,et a1.The 75kilodalton protein of Chlamydia trachomatis：a member of the heat shock protein 70family[J].Infect Immunity,1990,58(1)：189

［2］ Findlay HE,McClaferty H,Ashley RH.Surface expression，single-channel analysis and membrane topology of recombinant Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein[J].BMC Microbiol,2005,5(9):5

［3］ Sun G,Pal S,Sarcon AK,et a1.Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis[J].J Bacteriol,2007,189(17)：6222

［4］ ZhangD,YangX,BerryJ,et al.DNA vaccination with themajor outer membrane protein gene induces acquired immunity to Chlamydia trachomatis(mouse p neumonitis)infection[J].Infect Dis,1997,176(4):1035

［5］ 姚衛鋒，劉原君，李燕，等.衣原體噬菌體Chp3衣殼蛋白Vp1二級結構及B細胞抗原表位預測[J].天津醫科大學學報，2010，16(2):188

［6］ 馬棟蘋.基于改進BP神經網絡預測蛋白質二級結構[D].北京：北京工業大學.2005

［7］ 鄭婷婷，毛軍軍.Profile覆蓋算法在蛋白質二級結構預測中的應用[J].計算機技術與發展，2007，17(9)：171

［8］ Wallner B,Larsson P,Elofsson A.Pcons.net：protein structure prediction metaserver[J].Nucleic Acids Res,2007,35(Web Server issue)：W369

［9］ 孟翔燕，孟軍.基于遺傳算法的蛋白質二級結構預測方法研究進展[J].農業機械研究雜志，2009，5(4):1367

［10］馬棟萍，阮曉鋼.基于改進BP神經網絡預測蛋白質二級結構[J].北京聯合大學學報（自然科學版），2005，21(2):1430

［11］張維東，朱宏明.決策樹算法在蛋白質二級結構預測問題中的應用研究[J].微型電腦應用，2009，35(2):887

［12］賀東亮，崔曉東.過敏蛋白TBb的免疫活性鑒定及其表位預測[J].免疫學雜志，2009，36(2):632

［13］岳麗琴，沈敘莊.B族鏈球菌C5a肽酶蛋白表位的克隆、表達和免疫學分析[J].中華微生物學和免疫學雜志，2006，55(12):450