轉小粒野生稻基因組DNA水稻的光合性狀研究

匡 勇，袁 嬌，夏石頭，黃志遠，孫一丹，趙炳然

（1.湖南農業大學科學技術處，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學生物安全學院，

湖南 長沙410128；3.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；4.國交雜交水稻工程技術研究中心，湖南雜交水稻研究中心，湖南 長沙 410125）

水稻是我國最重要的糧食作物之一，兩系雜交水稻的推廣和應用對我國乃至世界的糧食生產將產生極為深遠的影響[1]。發掘和開發新的遺傳種質以提高兩系雜交水稻的雜種優勢是雜交水稻研究的重要課題。野生稻如小粒野生稻（Oryzaminuta，BBCC染色體組型）含有高產、病蟲抗性等基因，不僅耐逆能力強，而且持久抗稻瘟病、稻飛虱等病蟲害，發掘、轉移這些基因是水稻育種中的一個重要方向，轉移遠緣物種基因組DNA是一條不同于常規理化誘變的種質創新途徑。對基因組DNA進行直接操作，可能是利用遠緣有利基因、培育超級雜交稻行之有效的技術途徑。目前，外源DNA導入水稻的途徑主要有“花粉管通道法”[2]及種苗“浸泡法”，前者結實率低，籽粒易產生霉變、發芽率較低，操作時間又受到花時的限制，后者DNA用量較多且轉化率較低。在Pena等[3]程序基礎上，國交雜交水稻工程技術研究中心趙炳然等[4]用自行改良的“穗頸注射法”創造出一系列新種質材料。在此基礎上，作者以其中新種質野威B及其受體親本V20B為材料，研究了小粒野生稻基因組DNA轉移對受體水稻的光合性狀的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗采用轉小粒野生稻基因組DNA水稻野威B及其受體親本V20B為材料，由國交雜交水稻工程技術研究中心提供。

1.2 試驗設計

試驗在國家雜交水稻工程技術研究中心實驗田中進行。采取隨機區組設計，重復3次，小區面積20.0 m2，密度20 cm×20 cm，插單本。小區呈長方形，重復和區間設走道，實驗區周圍設保護區。田間管理同大田生產管理。

1.3 項目測定及方法

于始穗期（Ⅰ期）、齊穗期（Ⅱ期）、乳熟期（Ⅲ期）、黃熟期（Ⅳ期）、臘熟期（Ⅴ期）分別到田間各小區隨機取樣，用美國CID公司的CI203型葉面積儀測定葉片葉面積與長寬比，參照《植物生理學實驗技術》[5]用80%丙酮浸提法提取葉綠素，用分光光度法測定葉綠素含量。光合速率、氣孔導度、蒸騰速率等指標的測定采用美國LICOR公司的LI6400光合測試系統，采用開放式氣路，光通量密度為850 μmol/（m2·s），溫度為30℃。分別于9月1日（Ⅰ期）和9月18日（Ⅱ期）測定倒1（劍葉）、倒2、倒3葉光合性狀，測定時間為上午 9∶00～10∶00。

2 結果與分析

2.1 小粒野生稻（Oryzaminuta）DNA的導入和野威B材料的獲取

以V20B水稻親本作為野生稻（Oryzaminuta）DNA的受體材料，于田間選受體劍葉與倒2葉葉枕距1～5 cm的主穗，剝開部分倒2葉葉鞘以露出穗頸節下第1節間，然后將醫用微量進樣器針尖傾斜（約30°）從穗頸節部位朝下插入穗頸節下第1節間注射DNA。每穗注入50μLOryzaminuta基因組DNA溶液（DNA為1×SSC溶液，濃度為300～600 μg/mL）。種子收獲后單粒繁殖，從260株D1植株中篩選出1株變異株，變異株繁殖后從D2代中選出優良單株，D3代開始與V20A測交，D4代開始成對回交，經多代回交和系選，選育成變異系野威B。

2.2 轉Oryzaminuta基因組DNA水稻野威B的株葉形態和葉綠素含量

轉Oryzaminuta基因組DNA的野威B和親本V20B在株葉形態上有十分明顯的差異，野威B的株型較V20B松散，莖較V20B細小，倒3葉葉片較窄、較直立。在始穗期（Ⅰ期）、齊穗期（Ⅱ期）、乳熟期（Ⅲ期）、黃熟期（Ⅳ期）和臘熟期（Ⅴ期）分別到田間各小區隨機取樣，并用葉面積儀測定葉片的長、寬和葉面積（表1）后，發現在始穗期（Ⅰ期），轉O－ryzaminuta基因組DNA的野威B的倒1、倒2和倒3葉葉面積均顯著小于親本V20B，野威B的倒1、倒2和倒3葉的葉長、葉寬也小于親本V20B，且倒1和倒2的葉長、倒2葉葉寬與受體親本之間的差異達到了顯著水平。在齊穗期（Ⅱ期），野威B的倒1、倒2和倒3葉葉面積雖小于親本V20B的，但只有倒1葉的葉面積與受體親本之間的差異達到了顯著水平。而在乳熟期（Ⅲ期）、黃熟期（Ⅳ期）和臘熟期（Ⅴ期），野威B的倒1、倒2和倒3葉葉面積均顯著小于親本V20B，野威B的倒1、倒2和倒3葉的葉長、葉寬也小于親本V20B，有的差異達到顯著水平。進一步的研究發現（圖1、圖2），隨著水稻成熟野威B的倒1葉和倒2葉，從始穗期（Ⅰ期）、齊穗期（Ⅱ期）到乳熟期（Ⅲ期）再到黃熟期（Ⅳ期）和臘熟期（Ⅴ期），其葉綠素含量逐漸降低，但其與受體親本V20B之間的差異未達到顯著水平。

表1 轉Oryzaminuta基因組DNA野威B水稻的葉面積、葉長和葉寬

圖1 不同時期倒1葉葉綠素含量變化

圖2 不同時期倒2葉葉綠素含量變化

2.3 轉Oryzaminuta基因組DNA水稻野威B的光合性能和蒸騰速率

圖3 不同時期倒3葉葉綠素含量變化

轉Oryzaminuta基因組DNA的野威B和親本V20B的光合性能和蒸騰速率如表2。由表2可知，在2個測定時期，轉Oryzaminuta基因組DNA的野威B的倒1、倒2和倒3葉片的光合速率均極顯著高于親本V20B的光合速率。除第Ⅱ個時期倒1葉的氣孔導度與親本V20B的氣孔導度沒有顯著差異外，其他時期野威B的倒1、倒2和倒3葉的氣孔導度均顯著高于親本V20B的。在第一個測定時期，野威B的倒1、倒2和倒3葉片的蒸騰速率均顯著高于親本V20B各對應時期的蒸騰速率，但在第Ⅱ個時期，兩者之間的規律不明顯。

表2 轉Oryzaminuta基因組DNA野威B水稻的光合速率、氣孔導度和蒸騰速率

3 討論

轉移遠緣物種基因組DNA是一條不同于常規理化誘變的種質創新途徑，對基因組DNA的直接操作，可能是一種利用遠緣有利基因、培育超級雜交稻的行之有效的技術路線。外源DNA導入水稻的途徑，多是運用“花粉管通道法”[2]及種苗“浸泡法”。在Pena[3]程序基礎上，趙炳然、周建林等[4-9]用自行改良的“穗頸注射法”，創造出包括野威B在內的一系列新材料。而將3H-PBI121 DNA注入穗頸節下第一節間，放射性標記迅速在穗頸導管中出現，說明外源DNA通過導管運輸[10]。

本文研究發現，通過轉小粒野生稻（Oryza minuta）DNA而選育的變異系野威B，與親本V20B在株葉形態上有十分明顯的差異，野威B的株型較V20B松散，莖較V20B細小，倒3葉葉片較窄、較直立，而且野威B的倒1、倒2和倒3葉的葉面積均顯著小于親本V20B。從始穗期（Ⅰ期）、齊穗期（Ⅱ期）到乳熟期（Ⅲ期）再到黃熟期（Ⅳ期）和臘熟期（Ⅴ期），野威B和V20B的葉綠素含量逐漸降低，但兩者之間差異未達到顯著水平。野威B的倒1、倒2和倒3葉片的光合速率均極顯著高于親本V20B的光合速率。研究表明[11]，作物生物學產量中，90%～95%的物質來自光合作用的產物，只有5%～10%的物質是來自根部吸收的營養物質。從光合作用與物質生產的角度看，水稻產量主要決定于光合面積、光合時間、光合速率和物質分配。在一定產量水平下，其中某一因素起主導作用[12]。野威B的光合速率均極顯著高于親本V20B的光合速率，可為雜交水稻超高產育種，為進一步提高雜交水稻品質提供了新的種質資源。

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