天花粉蛋白、米非司酮和順鉑對卵巢癌細胞HLA-G表達的影響

王建英 馬俊英 吳淑娟 程建新 李勇

人類非經典白細胞抗原HLA-G在絨毛滋養細胞表面大量表達，是妊娠成功的必要條件，其在母胎免疫耐受方面的作用已經得到公認，目前也是腫瘤免疫逃逸基礎研究的熱點之一。已有研究報道了黃體酮、絨毛膜促性腺激素、孕激素等可通過上調HLA-G的水平以達到保胎的目的，由此推測臨床的引產藥物如天花粉蛋白、米非司酮等引起流產的機制可能與其能下調HLA-G的水平有關［1］，進而推測這些藥物在免疫逃逸方面具有抗腫瘤作用。本部分研究首先篩查出表達HLA-G陽性的卵巢癌細胞株，進而研究天花粉蛋白、米非司酮對其中HLA-G mRNA表達的影響，并與順鉑相比較，以其為卵巢癌的免疫治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養細胞:卵巢癌細胞株卵巢漿液性囊腺癌(SKOV3)、卵巢粘液性囊腺癌(3AO)、卵巢腺癌細胞株(OVCAR3)，由河北省腫瘤研究所科研中心提供。高表達HLA-G的絨毛膜癌JEG-3細胞株，購于中國科學院動物研究所計劃生育及生殖生物學國家重點實驗室。

1.1.2 主要試劑:RPMI1640細胞培養基購于美國Gibco公司;胎牛血清購于杭州四季青公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)購于Sigma公司;逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒購于Fermentas公司;引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。HLA-G上游引物為 5，-AGA CGC CAA GGA TGG TGG TCA-3，下游引物為 5，-GCTCCA CGT CCTGGG TCTGGT-3;βactin上游引物5，-AAG AGA GGC ATC CTC ACC CT-3，下游引物為5，-GGA AGG AAG GCTGGA AGA TG-3。擴增產物:HLAG為770 bp，β-actin為619 bp;HLA-G單克隆抗體購于英國Abcam公司;天花粉蛋白注射液購于上海金山制藥廠;米非司酮純品(RU486)購于北京紫竹藥業有限公司;順鉑購于山東齊魯制藥廠。

1.1.3 儀器設備:酶標儀 Fluostar(BMG，德國);CO2培養箱(Heraeus，德國);倒置顯微鏡(Olympus，日本);HEALORCE 超凈工作臺。PCR 儀(Mastercycler，eppendorf，德國)、凝膠分析成像系統(VILBER，LourMAT，法國)

1.2 方法

1.2.1 SKOV3、3AO、OVCAR3細胞培養:用含10%胎牛血清、100 U/m l青霉素、100 g/m l鏈霉素，在37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養，以0.25%胰蛋白酶消化，2～3 d傳代1次。

1.2.2 JEG-3細胞培養:用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/ml鏈霉素、2 mmol/L的DMEM/F12培養液，在37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養，以0.25%胰蛋白酶消化，2～3 d傳代1次。

1.2.3 RT-PCR技術:用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，用紫外分光光度法定量RNA。將等量的RNA反轉錄為cDNA第1鏈，以獲得的逆轉錄產物為模板，擴增HLA-G和β-actin基因，使用凝膠分析系統對擴增條帶進行密度分析，以平均灰度值代表相應基因的表達量，并除以β-actin的平均灰度值，所得數值做為各擴增產物mRNA的相對表達量。擴增條件:HLA-G為94℃預變性 3 min，94℃ 變性 45 s，55℃退火 45 s，72℃ 延伸1 min，30個循環，72℃延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳80 V 30 min，觀察基因表達變化。實驗重復6次。

1.2.4 四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)測定:取對數生長期的細胞，調整細胞濃度為2×105/ml，接種于96孔培養板中，每孔100μl，貼壁培養24 h后分別加入不同濃度的藥物或對照液100μl，每個濃度設6個復孔，每板設3個空白對照孔。細胞培養72 h后，每孔加入10μl MTT(濃度為5 mg/ml)，繼續培養4 h后，棄培養液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μl，振蕩10 min，酶標儀在600 nm處測定每孔吸光度(A)值，每個濃度6個平行孔，取平均值。并按如下公式計算各組細胞的生長抑制率。實驗重復5次。細胞生長抑制率=(對照孔A值-實驗孔A值)/對照孔A值×100%。80 V 30 min，觀察基因表達變化。實驗重復2次。

1.2.5 藥物濃度:用不含胎牛血清的RPMI1640細胞培養液來調節天花粉蛋白和順鉑藥物濃度，每種藥物為5個濃度。天花粉蛋白注射液的終濃度 10、50、100、500、1 000 μg/ml。順鉑的終濃度為 1.5625、3.125、6.25、12.5、25 μg/ml。以等量的RPMI1640培養液為對照。

米非司酮純品以無水乙醇溶解，配成10 mg/ml，再以RPMR1640培養液稀釋至所需濃度，試驗組米非司酮終濃度分別為 2.5、5、10、20、40 μg/m l。為避免乙醇對試驗的影響，設 5個乙醇對照組，使乙醇終濃度與各試驗組乙醇含量一致。

RT-PCR技術:參照上述結果，選擇干預細胞的藥物濃度。天花粉蛋白注射液濃度為500、1 000μg/ml;米非司酮濃度為20、40 μg/m l;順鉑濃度為6.25、12.5 μg/ml。各組藥物分別作用于實驗篩查出表達HLA-G陽性的OVCAR3細胞72 h。

1.3 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以±s表示，組間均數先進行方差齊性檢驗，再進行方差分析，用LSD法進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢癌細胞HLA-GmRNA表達 以絨癌JEG-3細胞為陽性對照，人卵巢癌OVCAR3細胞株呈現HLA-G mRNA陽性表達，可見擴增片段長度為770 bp(HLA-G)和619 bp(β-actin)的特異性條帶。SKOV3和3AO細胞中均未檢測到HLA-G mRNA表達。見圖1。

圖1不同細胞株HLA-GmRNA的表達

2.2 天花粉蛋白、米非司酮、順鉑對卵巢癌細胞株OVCAR3生長的抑制作用 天花粉蛋白、米非司酮、順鉑對OVCAR3細胞生長抑制作用均呈濃度依賴性。見表1。

表1不同藥物對卵巢癌細胞株OVCAR3生長的抑制作用±s

表1不同藥物對卵巢癌細胞株OVCAR3生長的抑制作用±s

天花粉蛋白濃度(μg/ml)抑制率米非司酮濃度(μg/ml)抑制率順鉑濃度(μg/ml)抑制率0 0 0 0 0 0 10 1.06±0.14 2.5 8.00±1.21 1.5625 17.82±7.29 50 9.03±1.81 5 24.88±11.30 3.125 29.25±2.72 100 14.95±8.43 10 47.60±2.70 6.25 60.15±5.69 500 39.66±9.67 20 61.58±3.29 12.5 70.57±3.74 1 000 58.65±9.63 40 76.94±4.68 25 85.67±8.24

2.3 天花粉蛋白、米非司酮、順鉑對OVCAR3細胞中HLA-G表達的影響 天花粉蛋白、米非司酮能明顯下調OVCAR3細胞中HLA-G mRNA表達水平(P＜0.01)，而順鉑卻無該方面作用(P ＞0.05)。見表2。

表2 不同藥物對OVCAR3細胞中HLA-G表達的影響

3 討論

本課題組前期試驗已經表明HLA-G、HLA-E在卵巢癌免疫逃逸中起著重要作用，可做為臨床判斷腫瘤惡性程度、監測腫瘤復發及判斷預后的一項腫瘤標志物，提示若能找到某種藥物來下調或封閉HLA-G、HLA-E的表達，就有可能為臨床卵巢癌免疫治療提供一個新的靶點［2］。

本試驗以絨癌JEG-3細胞做為陽性對照，檢測了不同卵巢癌細胞株中HLA-G的表達情況，結果表明在SKOV3細胞和3AO細胞都不表達HLA-G，只有在 OVCAR3細胞有 HLA-G mRNA電泳條帶出現。細胞系中HLA-G的表達低于腫瘤組織，同國外學者研究結果相似。Bukur等［3］研究發現在被檢測的30例腎癌腫瘤標本中24例有HLA-G mRNA表達，而在23個細胞系中僅12例有HLA-G mRNA表達。還有文獻報道HLA-G抗原在黑色素瘤標本中近30%表達，而在細胞系中卻不到1%［4］。分析產生這些差異的原因可能是:(1)不同腫瘤微環境的影響;(2)腫瘤浸潤細胞的影響，因為它們也表達HLA-G;(3)在細胞培養過程中HLA-G抗原會逐漸部分丟失;(4)在建立穩定傳代的細胞系過程中不可避免發生某種程度的細胞選擇，從而使HLA-G陽性細胞可能被篩選掉。

本部分結果表明雖然不同卵巢癌細胞株表達HLA-G水平有所不同，但還是從細胞水平驗證了HLA-G在卵巢癌免疫逃逸方面的作用。故以OVCAR3做為下一步進行藥物干預實驗的細胞株。

王英俊［5］研究發現天花粉蛋白(TCS)可誘導胃癌細胞株SGC-7901凋亡，凋亡率與藥物濃度及作用時間呈正相關。王媛媛等［6］探討了TCS對人白血病和淋巴瘤細胞系的殺傷作用機制，結果表明TCS可以顯著抑制各種白血病細胞系的增值。目前關于TCS與卵巢癌關系的研究報道極少。本組資料顯示，天花粉蛋白從50μg/ml濃度開始對卵巢癌細胞株OVCAR3表現出抑制作用，而且濃度越高，抑制作用越強，1 000μg/ml時，抑制作用達到58.65%。體外實驗表明天花粉蛋白對卵巢癌具有抗腫瘤作用。

目前對天花粉蛋白抗癌機制的研究并不很深入，主要集中于以下幾方面:抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡;抑制腫瘤細胞蛋白質的合成;促進NK細胞活性，提高機體免疫力;提高紅細胞免疫黏附功能，增強腫瘤細胞抗原性，從而增強抗癌免疫反應等［7-9］。本實驗發現天花粉蛋白能明顯下調OVCAR3細胞HLA-GmRNA表達水平，而且1 000μg/ml組中HLA-G光密度值顯著低于500μg/m l組。抗原水平下調和藥物濃度有關，濃度越高，抗原水平越低。因此為天花粉蛋白的抗腫瘤機制提供了另一種可能途徑，即通過下調人類白細胞抗原HLA-G、HLA-E水平，解除其與NK細胞、細胞毒性T細胞抑制型受體結合，從而恢復免疫細胞的殺瘤作用而實現的。這為天花粉蛋白的開發和臨床應用提供了有力的依據。

抗孕激素米非司酮(RU486，mifepristone)由法國Roussel-Uclaf公司于1980年最先合成，作為一種抗早孕藥物在臨床被推廣使用。米非司酮臨床應用領域不斷拓寬，并在婦科腫瘤及其他腫瘤如子宮內膜癌、乳腺癌、卵巢癌、腦膜瘤、胃癌治療等方面進行探索性應用［10-12］。本實驗顯示米非司酮對卵巢癌細胞系OVCAR3表現出濃度依賴性的抑制作用，表明米非司酮對卵巢癌有較強抗腫瘤作用。目前米非司酮治療卵巢癌作用機理研究主要局限于拮抗孕激素這一機制，其他方面的報道極少。本組資料中，通過對卵巢癌細胞體外實驗研究，我們首先得出結果米非司酮對卵巢癌細胞有明顯的增殖抑制作用，然后通過RT-PCR方法基因轉錄水平檢測發現米非司酮能明顯下調OVCAR3細胞HLA-G基因mRNA表達水平，同樣從腫瘤免疫逃逸機制方面闡明了米非司酮抗腫瘤作用的另一機制，即下調非經典白細胞抗原HLA-G，阻斷他們同免疫細胞抑制性受體的結合，恢復免疫細胞的活性，達到殺傷腫瘤細胞的目的。

做為治療卵巢癌最常用的化療藥物，順鉑作用機制主要是攻擊DNA堿基的氮原子，與DNA形成交叉連結，使DNA的模板作用失活，因而可抑制DNA合成。本研究中順鉑對卵巢癌OVCAR3細胞中HLA-G抗原mRNA表達無明顯影響。研究結果表明順鉑做為最重要的治療卵巢癌藥物，作用機制方面可能沒有參與解除HLA-G誘導的腫瘤免疫逃逸過程。天花粉蛋白和米非司酮治療卵巢癌的作用機制同順鉑有所不同，與順鉑聯合應用，可能會取得更好的治療效果，為進一步動物移植瘤模型觀察藥物療效提供可行性依據［13］，從而為臨床制定合理的化療方案提供依據。

1 朱衛紅，魏國華，孫進.天花粉蛋白羊膜腔注射配伍米百司酮用于高危中期妊娠引產的療效分析.中國全科醫學，2009，26:1006-1007.

2 王建英，許茜，吳淑娟，等.卵巢惡性腫瘤組織中HLA-G、HLA-E的表達及意義.山東醫藥，2010，50:1-3.

3 Bukur J，Malenica B，Huber C，et al.Altered expression of nonclassical HLA class Ib antigens in human renal cell carcinoma and its association with impaired immune response.Hum Immunol，2003，64:1081-1092.

4 Chang CC，Murphy SP，Ferrone S.Differential in vivo and in vitro HLA-G expression in melanoma cells:potential mechanisms.Hum Immunol，2003，64:1057-1063.

5 王英俊.天花粉蛋白對胃癌細胞株SGC-7901凋亡影響的體外研究.中國醫藥導報，2007，16:231-234.

6 王媛媛，歐陽東云，鄭永唐.天花粉蛋白體外抗人白血病和淋巴瘤細胞的作用機制.中國試驗血液學雜志，2007，15:729-732.

7 黃益玲，黃利鳴，石新蘭，等.天花粉蛋白對宮頸癌HeLa細胞增殖和細胞凋亡的影響.中國藥理學通報，2005，21:253-254.

8 孫璟，涂水平，吳裕炘，等.天花粉蛋白誘導胃癌細胞MKN-45凋亡中P53、Bcl-2、C-myc 蛋白表達變化.上海醫學，2004，24:292-294.

9 田維毅，馬春玲，白惠卿.天花粉及其組份對小鼠NK細胞殺傷活性的影響.貴州中醫，2001，25:982-984.

10 Poole AJ，Li Y，Kim Y，etal.Prevention of Brca1-mediatedmammary tumorigenesis in mice by a progesterone antagonist.Science，2006，314:1467-1470.

11 Goyeneche AA，Carón RW，Telleria CM.Mifepristone inhibits ovarian cancer cellgrowth in vitro and in vivo.Clin Cancer Res，2007，13:3370-3379.

12 Grunberg SM，Weiss MH，Russell CA，et al.Long-term administration of mifepristone(RU486):clinical tolerance during extended treatment of meningioma.Cancer Invest，2006，24:727-733.

13 王建英，許茜，吳淑娟，等.藥物對卵巢癌裸鼠移植瘤組織中HLAG、HLA-E 表達的影響.河北醫藥，2009，31:2878-2880.