IVF-ET中觀察胚胎早期卵裂預測胚胎發育潛力的研究

單旭東 梁 鑫 漆 著 黃明孔

成都中醫藥大學第二附屬醫院,四川生殖衛生學院(610041)

如何選擇最優質的胚胎進行移植從而獲得較高的妊娠率是人類輔助生殖技術(ART)的重要部分。一般選擇移植胚胎的方法是在胚胎發育的不同階段根據胚胎的外部形態對其評分從而得到相對優質的胚胎。由于 ART獲得的胚胎有高達 50%可能存在遺傳學缺陷[1],現在越來越多的生殖中心嘗試通過囊胚移植的方法存優去劣。但囊胚培養的效率低,且存在無囊胚可移植的風險,并不能應用于所有患者。更多的生殖中心仍然選擇在第 3天(D3),甚至第 2天(D2)進行胚胎移植,這就要求在胚胎發育的更早期階段對其進行評價,選擇優質可移植的胚胎。對胚胎早期卵裂情況進行觀察早在 2001年即被認為是選擇D3移植胚胎的有效方法[2],Fisch等[3]在 2003年提出了改進的胚胎評分標準(GES),首次將早期卵裂的觀察方法系統地應用于胚胎評分中,以此預測胚胎的發育潛力,在 D3選擇出最優秀的胚胎進行移植,并得到了較好的結果。本研究的主要目的在于探討觀察胚胎早期卵裂情況是否能夠有效指導臨床,得到較高的妊娠率。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2008年 12月 29日 ～2010年 1月 1日在本中心進行體外受精 -胚胎移植(IVF-ET)/卵胞漿內單精子注射(ICSI)治療的 117個周期,女方年齡 32.1±5.5歲。

1.2 方法

1.2.1 促排卵、受精與胚胎觀察 采用經典長方案促排卵,月經第 21天注射達必佳 0.1mg/d,至下次月經第 3天根據卵泡情況注射促性腺激素(Gn),當優勢卵泡達到 18mm時注射人絨毛膜促性腺激素(hCG),注射后 34～37h取卵,取卵后 3～6h受精。精子密度為(0.1～0.5)×106/m l。胚胎采用微滴培養法,在37℃,5.5%CO2,92%～95%濕度狀況下培養至 D3。受精后 17～19h觀察原核(PN),23～27h觀察早期卵裂(ICSI周期一般在 23～26h,IVF周期在 24～27h),41～42h觀察 D2胚胎發育情況,65～67h觀察D3胚胎發育情況。

1.2.2 胚胎形態學評分 按照胚胎形態學對胚胎進行評分,包括卵裂球數目、大小、形狀、碎片和透明帶的厚度及完整性等。胚胎形態學評分標準如下[4,5]：①4分,細胞大小均勻且形狀規則,透明帶完整,胞質均勻清晰,無顆粒現象,碎片 ＜5%;②3分,細胞大小略不均勻,形狀略不規則,胞質可有顆粒現象,碎片10%～20%;③2分,細胞大小明顯不均勻,可有形狀明顯不規則,胞質可有顆粒現象,碎片 21%～50%;④1分,細胞大小嚴重不均,胞質可有嚴重顆粒現象,碎片 ＞50%。

1.2.3 優質胚胎選擇與移植 對進行了早期卵裂觀察的正常受精胚胎(17～19h觀察 PN為 2的胚胎)進行分析。D2優胚以當天卵裂球數為 4,評分≥3為標準;D3優胚以當天卵裂球數 7～9,評分≥3為標準[3]。D3結合胚胎發育和評分情況選擇優質的胚胎進行移植,移植周期患者 hCG日子宮內膜厚度均 ＞8mm。移植后 14d通過血 hCG確定生化妊娠,移植后 28d通過 B超確定宮內孕囊,可見胎芽及胎心診斷為臨床妊娠。

1.2.4 胚胎分組評價 ①按照胚胎的早期卵裂情況,將正常受精胚胎分為 4組,分別為早期卵裂組、未早期卵裂組、PN未消失組和其它胚胎組(包括 23～27h時表現為 1PN或碎片化的胚胎),對各組的 D2、D3優胚率分別進行統計;②根據移植胚胎的早期卵裂情況將移植周期分為 4組：全部移植早期卵裂胚胎組、全部移植未早期卵裂胚胎組、全部移植 PN未消失胚胎組和混合組,對 4組的生化妊娠率、臨床妊娠率和種植率以及前 3組中完全移植優胚周期的臨床妊娠率(以下簡稱優胚臨床妊娠率,即完全移植優胚周期妊娠數/完全移植優胚周期數 ×100%)和完全移植優胚周期種植率(以下簡稱優胚種植率,即完全移植優胚周期種植胚胎數/完全移植優胚周期移植胚胎數×100%)等指標進行統計;③根據 D3時移植胚胎中含有優胚的數目,將移植周期分為：移植 2～3個優胚組,移植 1個優胚和 1～2個非優胚組以及未移植優胚組,比較這 3組周期的妊娠率和種植率等。

1.3 統計學方法

數據采用 SPSS 13.0軟件進行統計分析,樣本陽性率的比較采用 χ2檢驗。

2 結果

2.1 早期卵裂胚胎與優胚率

正常受精胚胎的 D2、D3優胚率統計結果見表 1。

表 1 早期卵裂與優胚率關系(%)

早期卵裂組和未早期卵裂組的 D2、D3優胚率差異無統計學意義(P＞0.05),但與 PN未消失組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。在早期卵裂組中,早期卵裂數目為 2且評分≥3的胚胎的 D3優胚率最高,為 73.9%;而早期卵裂數目≥3或評分 ＜3的胚胎 D2、D3優胚率較低,其 D3優胚率分別為 27.3%和 33.3%。另外,年齡 ＜35歲和≥35歲患者的胚胎早期卵裂率分別為 26.4%(193/732)和 26.5%(43/162),兩者間差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 早期卵裂與妊娠率

在進行了早期卵裂觀察的 117個周期中,共 102個周期在 D3進行了鮮胚移植,生化妊娠 53個周期,臨床妊娠 43個周期,移植周期生化妊娠率(52.0%)大于同期未進行早期卵裂觀察的移植周期生化妊娠率(43.5%)。102個周期共移植 220個胚胎,其中早期卵裂胚胎 79個,未早期卵裂胚胎 63個,PN未消失胚胎 78個。根據移植胚胎的早期卵裂情況將移植周期分組統計,結果見表 2。

表 2 早期卵裂情況與妊娠率的關系

4組患者年齡差異無統計學意義。全部移植早期卵裂胚胎組的生化妊娠率高于另外 3組(P＜0.05),但 4組間臨床妊娠率差異無統計學意義(P＞0.05)。全部移植未早期卵裂胚胎組的種植率高于全部移植早期卵裂胚胎組和全部移植 PN未消失胚胎組(P＜0.05),但與混合組差異無統計學意義(P＞0.05)。全部移植早期卵裂胚胎組優胚種植率顯著低于全部移植未早期卵裂胚胎組和全部移植 PN未消失胚胎組(P＜0.05)。全部移植 PN未消失組的優胚臨床妊娠率顯著高于全部移植早期卵裂組和全部移植未早期卵裂組(P＜0.05)。

2.3 優胚率與妊娠率

根據移植周期的優胚情況分組統計結果見表 3。移植胚胎中含有優胚的兩組生化妊娠率、臨床妊娠率和種植率均顯著高于不含優胚組(P＜0.05)。

3 討論

對胚胎早期卵裂的觀察可以有效預見胚胎的發育潛力,對優質胚胎的選擇具有重要意義[6]。早期卵裂結合 PN評分或 D2四細胞單核的觀察以及囊胚的評分等方法已有所研究[3,7],多數觀點認為早期卵裂的胚胎能夠得到較高的優胚率或囊胚形成率[2,3],從而可以提高移植的妊娠率。一些報道進行了更細致的研究,將早期卵裂的情況進行了分類和評分,認為只有卵裂時形態正常、碎片少,卵裂數目為 2的胚胎才能得到好的結果[2,3,6,8]。本研究中,24～28h實現了早期卵裂的胚胎在 D3的優胚率顯著高于未早期卵裂胚胎和 PN未消失胚胎,但早期卵裂數目≥3或評分 ＜3的胚胎優胚率顯著低于卵裂球數為 2且評分 ＞3的胚胎,這與上述觀點中早期卵裂可以得到較高優胚率的看法基本相同。

表 3 優胚與妊娠率的關系

另有報道認為早期卵裂僅能預測胚胎的發育潛力,與妊娠結局關系不大[9]。從本文結果看,早期卵裂的形成與患者年齡無關,患者年齡的差異并不能通過早期卵裂的形成影響妊娠率。總結本研究中早期卵裂與妊娠率、種植率的關系后,筆者發現早期卵裂組與未早期卵裂組以及 PN未消失組的生化妊娠率存在差異,但臨床妊娠率無差異。僅就 D3優質胚胎而言,PN未消失組的臨床妊娠率和種植率等指標反而好于其它周期,單獨觀察優胚移植周期,早期卵裂組優胚的種植率也顯著低于 PN未消失組和未早期卵裂組,而移植了優胚的周期,無論在生化妊娠率、臨床妊娠率和種植率上都遠優于未移植優胚的周期。可以看出,臨床妊娠率與種植率的高低更多取決于優胚而非早期卵裂情況。

分析研究結果,筆者認為通過觀察胚胎早期卵裂的方法可以預測胚胎的發育潛能,有效預測優胚率,移植優質的早期卵裂胚胎可以提高生化妊娠率,但對臨床妊娠率和種植率的影響不大,決定臨床妊娠率和種植率的最具實際意義的指標仍然是優質胚胎。筆者認同對胚胎早期卵裂觀察的方法對于 D2進行移植的周期具有一定的意義[10],對 D3及之后的胚胎移植僅起輔助作用,不能單獨應用。本文中 PN未消失組的胚胎一旦發育為優胚則具有較高的妊娠率,這可能與胚胎發育中的補償機制有關,確切原因還需進一步研究。

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2 Fisch JD,Rodriguez H,Ross R,et al.The Graduated Embryo Score(GES)predicts blastocyst formation and pregnancy rate from cleavage-stage embryos[J].Hum Reprod,2001,16：1970-1975.

3 Fisch JD,Sher G,Adamoviczm,et al.The graduated embryo score predicts the outcome of assisted reproductive technologiesbetter than a single day 3 evaluation and achieves results associated with blastocyst transfer from day 3 embryo transfer[J].Fertil Steril,2003,80：1352-1358.

4 陳子江.人類生殖與輔助生殖[M].北京：科學出版社,2005：430.

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6 Ciray HN,Karagenc L,Ulug U,et al.Early cleavagemorphology affects the quality and implantation potentialof day 3 embryos[J].Fertil Steril,2006,85：358-365.

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9 Summers-Chase D,Horwath D,Yuan W,et al.Pregnancy rates with and without transferring embryos,which showed early cleavage[J].Fertil Steril,2004,82(Suppl 2)：220.

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