凍融胚胎植入前遺傳學篩查的研究

李曉曄 白曉紅

天津醫科大學生殖醫學中心(300052)

在體外受精 -胚胎移植(IVF-ET)周期中易發生染色體異常,尤其是出現非整倍體改變,在高齡婦女中尤其突出[1]。染色體的非整倍體改變是導致胚胎移植后受孕率和著床率低而流產率高的重要原因之一。本研究通過熒光原位雜交(FISH)方法檢測體外受精胚胎的 18及 X/Y等染色體的單體、三體、多倍體等異常分布情況,探討 FISH技術對植入前胚胎進行常見染色體異常診斷的可行性與實用性,以及影響胚胎染色體異常的可能因素。

1 材料與方法

1.1 材料

選取 2007～2009年在本生殖中心凍存的 42枚正常胚胎,經患者夫婦知情同意后將其解凍。IVF組胚胎 24枚,卵細胞漿內單精子注射(ICSI)組胚胎 18枚。女方年齡 31.41±5.17(26～42)歲,男方年齡34.23±4.58(24～43)歲。按病因分類為輸卵管因素 18例(42.85%),男方少弱精癥 14例(33.33%),排卵障礙 6例(14.29%),雙方因素 4例(9.52%)。

1.2 主要試劑及來源

胚胎解凍及培養 ：G-IVF、HSA-solution、解凍液等均購自 Sigma公司;卵裂球固定：Tyrode酸性液購自 Sigma公司;PBS干粉、牛血清白蛋白(BSA)、乙酸鈉、Tween-20均購自天津市康科德科技有限公司;濃鹽酸、甲醇、冰乙酸等購自天津市北辰區柳灘工業區;FISH試劑：FISH DNA探針、雜交緩沖液、DAPI復染劑購自北京金菩嘉醫療科技有限公司;NP-40購自 Sigma公司;20×SSC、2×SSC、無水乙醇和氫氧化鈉(NaOH)購自天津市化學試劑一廠。

1.3 方法

1.3.1 卵裂球活檢 ①胚胎解凍后移入無 Ca2+,Mg2+的 PBS微滴中,于 37℃、5%CO2培養箱中培養 10min;②將胚胎轉移入 G-IVF培養液微滴中,清洗兩次后移入 pH 2.2 Tyrode液中消化透明帶;③將酸性液清洗干凈后,用毛細玻璃管反復吹打胚胎,直到卵裂球完全裂開,吸取單個卵裂球;④活檢出的卵裂球移入置乙酸鈉微滴的培養皿中低滲 5min。每個胚胎活檢后剩余卵裂球均與活檢卵裂球行同樣操作。

1.3.2 卵裂球細胞固定 用口吸管將單個卵裂球移至 0.1%Tween-20/0.01M HCl裂解液中,并以裂解液為輔展液迅速轉移至載玻片標定區域內。在倒置顯微鏡下觀察細胞膨脹、破裂、核游離情況。自然干燥后固定。

1.3.3 FISH ①避光條件下制備探針混合物;②置 75℃水浴中共變性;③42℃溫箱雜交過夜;④洗脫非特異性雜交;⑤ DAPI復染;⑥熒光觀察和結果判斷：應用 FISH 2.0分析軟件進行圖像分析。CSP18、CSPX和 CSPY激發信號分別呈藍色、綠色和紅色。細胞核中出現 2個熒光信號為二體型胚胎,出現一個信號為單體型胚胎,出現≥3個信號為多體型胚胎。若同一胚胎中每個卵裂球雜交信號一致,則認為整個胚胎為該染色體核型;有雜交信號而卵裂球間出現的信號不一致,則該胚胎為嵌合體。

1.3.4對照實驗 隨機選取 2010年 6～12月本院產前診斷中心唐氏綜合征(DS)血清學篩查高風險的孕婦 20例。B超引導下行經腹羊膜腔穿刺術抽取羊水 20m l,其中 15m l行染色體核型分析,羊水細胞培養制片、G顯帶,并按照人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN,1995)進行核型分析;余 2～3m l經低滲、固定處理后,直接與固定好的單個卵裂球細胞在相同條件下行 FISH檢測。計數至少 100個細胞,異常細胞比例 ＞60%,提示該樣本異常;異常細胞比例 ＜10%,提示該樣本無異常;如果異常細胞比例 10%～60%,加大觀測樣本細胞數目,如實記錄異常細胞比例。

1.4 統計學分析

采用 SPSS17.0統計軟件包進行統計分析,計量資料用±s表示,采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 FISH與核型分析結果的一致性

核型分析結果顯示,20例羊水細胞培養均成功,檢測出異常核型 1例：47,XXY。FISH分析結果顯示,20例羊水標本均出現清晰雜交信號并成功分析得出結果,成功率 100%,1例樣本指標異常(47,XXY),與核型分析一致。FISH的非整倍體敏感性為 50%,特異性為 100%,與核型分析的符合率達 95%。

2.2 胚胎活檢和卵裂球固定情況

共獲取單個卵裂球 39個,均細胞完整、胞核清晰,活檢成功率為 92.86%(39/42)。剩余卵裂球 73個,全部進行 FISH檢測。共 112只卵裂球細胞,成功固定了 97個,固定成功率為 82.61%(97/112)。

2.3 卵裂球細胞的雜交情況

固定成功的 97只卵裂球中,90只可見熒光信號,雜交成功率為 92.78%(90/97)。

2.4 受精方式與胚胎染色體異常的關系

IVF組與 ICSI組嵌合體及染色體異常發生率見表 1,兩組胚胎染色體異常率(χ2=0.198,P＞0.05)和嵌合體發生率(χ2=1.206,P＞0.05)比較,均無明顯差異。

表 1 受精方式與胚胎染色體異常的關系

2.5 年齡、超促排卵(COH)方案與胚胎染色體異常的關系

將所有患者以年齡 35歲為界分為兩組,年齡≥35歲組染色體異常率(56.52%)高于 ＜35歲組(34.78%),但兩組差異無統計學意義(χ2=1.768,P=0.184)。兩組嵌合率的差異有統計學意義(43.75%vs 17.39%,χ2=6.865,P＜0.05)應用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)長方案的胚胎染色體異常率(35.29%)與應用短方案(45.45%)的比較,差異無統計學意義(χ2=0.666,P＞0.05)。

2.6 促性腺激素(Gn)用量和 Gn給藥天數與染色體異常的關系

Gn用量為 23.98±9.171支,Gn用藥天數為9.02±1.248天。按 Gn用量分為≥20支和 ＜20支兩組;按 Gn給藥天數分為≥9d和 ＜9d兩組。由表 2可知,Gn用量與染色體異常的發生關系較密切(χ2=4.744,P=0.029),而 Gn給藥天數對染色體異常的發生無明顯影響(P＞0.05)。

表 2 Gn用量和 Gn給藥天數與染色體異常的關系

3 討論

雖然單周期 IVF-ET技術的臨床妊娠率己高達60%,總體妊娠率卻依然較低。為了提高 IVF-ET成功率,降低染色體病患兒出生率,對胚胎染色體進行非整倍體篩查,選擇最佳胚胎移植顯得十分必要,因為胚胎質量與染色體整倍體性相關,胚胎質量越差,染色體異常率也越高[2]。在 IVF周期中,首選正常受精且質量較好的胚胎進行移植,然而盡管有些胚胎有較好的外形及發育程度,但因其染色體異常,仍導致移植失敗。Baart等[3]于 2006年利用 FISH方法研究了年輕女性胚胎的 10條染色體,發現僅 36%的胚胎有正常二倍體狀態。本研究中所選樣本均為正常受精的優質凍存胚胎,理論上染色體應該為正常的二倍體核型,但結果發現優質凍存胚胎的染色體異常率約為 35.90%,二倍體率為 64.10%,與 Baart等的研究結果一致。另外,我們選擇的研究對象是正常凍存胚胎,解凍后也可能有一定程度的染色體畸變[4]。

35歲以上,尤其 40～45歲女性卵細胞的染色體非整倍體率明顯上升,確切原因尚不清楚,可能與高齡女性卵細胞的紡錘體老化和同源染色體間的交叉互換減少有關[5],也可能與環境中各種物理、化學、生物等不良因素的積累效應有關。且各種環境因素均可引起卵細胞的減數分裂異常,長期綜合作用所產生的累積效應對高齡女性卵細胞產生的影響較年輕女性大[6]。本研究中,高齡患者的染色體異常嵌合率明顯增高。因而對于35歲以上行 IVF-ET治療的女性,應做好遺傳咨詢工作,建議對其胚胎或卵細胞進行染色體非整倍體的植入前診斷。故提高非整倍體疾病的產前診斷水平,在當前尤為重要。

COH方案對胚胎染色體異常的影響不明確。Gn用量則能影響染色體異常的發生率。本研究結果顯示,促排卵藥物劑量越大,胚胎染色體異常率越高。有研究表明,體外成熟(IVM)培養過程中,高濃度的卵泡刺激素(FSH)可明顯提高第一次減數分裂的錯誤幾率,從而出現更多的非整倍體卵母細胞[7]。Roberts等[8]對 IVM過程中的小鼠卵母細胞進行研究,結果表明暴露在高濃度 FSH中的卵母細胞核成熟率提高得非常明顯,而胞漿成熟缺陷可能導致卵裂時的紡錘體缺陷,增加其非整倍體發生率和染色體異常發生率。另外,COH過程中患者體內激素水平發生巨大改變,卵泡液中激素水平的改變會影響卵子質量,較高的雌激素可能在 ICSI時影響卵子的正常受精[9]。

受精方式可能會影響胚胎染色體異常情況。ICSI技術是一種有創性操作,向卵母細胞注入精子的同時,可能會造成細胞骨架或紡錘體的損傷,而人為的精子選擇不當、外源性物質的侵入等也會導致胚胎染色體異常的形成機會增加;非 ICSI技術因素,如有遺傳學方面缺陷的精子,可能會避開自然篩選和淘汰的過程直接將缺陷垂直遺傳給子代[10]。Retzloff等[11]卻認為常規 IVF獲得的胚胎和 ICSI獲得的胚胎染色體異常率無統計學上的差異。本研究中也未得出某種受精方式會增加胚胎染色體異常的結論。因此,關于受精方式對染色體異常情況的影響,仍需要進一步大量的實驗研究進行驗證。

嵌合體在人類植入前胚胎中很常見,可能是影響 IVF-ET周期成功率的重要因素之一。產生機制仍不明確,應該是在胚胎發育過程中,減數分裂發生錯誤,導致染色體丟失。Ren等[12]發現在正常受精但不適宜移植和冷凍的胚胎中 31.4%是嵌合體。由于胚胎的來源和選用的探針不同,在各種報道中,嵌合型胚胎的比例也不甚相同。但能確定的是,隨著胚胎的發育,細胞連續分裂次數的增多,發生分裂錯誤的機會增加,發生染色體嵌合的機會也增加。在人類正常受精的胚胎中,染色體嵌合現象非常普遍,有可能導致胚胎種植前遺傳學診斷(PGD)的誤診,并降低 PGD的準確性[13]。本研究顯示,胚胎的嵌合率為 20.51%,較之前研究比率偏低,可能與檢測的染色體數目較少有關。Baart等[14]發現篩查更多的染色體可能提高異常胚胎的檢出率。但是由于嵌合體胚胎移植后的結局也尚未明確,臨床植入前遺傳學篩查(PGS)中額外檢查其他染色體的價值仍不明確。

傳統的 PGD診斷直接對單細胞進行多重 PCR擴增,較 FISH方法更經濟。但由于 DNA模板量少,難以滿足一個基因多種突變、多個基因檢測以及對結果行重復性驗證的需要,最突出的問題是擴增失敗、等位基因脫扣和易受到其他 DNA序列的污染。雖然FISH方法花費較高,增加了不孕患者的負擔,但在遺傳學診斷中利用 FISH法對植入前胚胎的染色體進行分析有較高的準確性,可以篩選高質量的胚胎,以利于提高植入率;可以避免性染色體異常以及三體患兒出生;還可以對患有遺傳學疾病夫婦的胚胎進行篩選,排除病變胚胎,避免將疾病遺傳給子代。隨著分子生物學技術的迅速發展,FISH技術已得到不斷改進和完善,靈敏度和分辨率不斷提高,已成為生殖醫學以及遺傳學領域中極為重要的研究和檢查手段。

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3 Baart EB,Martini E,van den Berg I,et al.Preimplantation genetic screening reveals a high incidence of aneuploidy and mosaicism in embryos from young women undergoing IVF[J].Hum Reprod,2006,21：223-233.

4 Salumets A,Horelli-Kuitunen N,SuikkariAM,etal.Elevated incidence of chromosomally chaotic embryos among frozen-thawed preimplantation embryos[J].Eur JObstet Gynecol Reprod Biol,2004,114(1)：59-63.

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7 Xu YW,Peng YT,Wang B,et al.High follic le-stimulating hormone increases aneuploidy in human oocytesmatured in vitro[J].Fertil Steril,2011,95(1)：99-104.

8 Roberts R,Iatropoulou A,Ciantar D,etal.Follicle-stimulating hormone affects metaphase I chromosome alignment and increase aneuploidy inmouse oocytesmatured in vitro[J].Biol Reprod,2005,72(1)：107-118.

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10 Plachot M,Belaisch-Allart J,Mayenga JM,et al.Outcome of conventional IVF and ICSIon sibling oocytes inm ildmale factor infertility[J].Hum Reprod,2002,17(2)：362-369.

11 Retzloff MG,Hornstein MD.Is intracytoplasm ic sperm injection safe?[J].Fertil Steril,2003,80(4)：851-859.

12 Ren XL,Xu YW,Zhou CQ,et al.Analysis of chromosomemosaicism in preimplantation embryos by using 2 sequential rounds of fluorescence in situ hybridization.Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi.2007,24(6)：706-708.

13 Dupont C,Segars J,DeCherney A,et al.Incidence of chromosomal mosaicism in morphologically normal nonhuman primate preimplantation embryos[J].Fertil Steril,2010,93(8)：2545-2550.

14 Baart EB,van den Berg I,Martini E,et al.FISH analysis of 15 chromosomes in human day 4 and 5preimplantation embryos：the added value of extended aneuploidy detection[J].Prenat Diagn,2007,27(1)：55-63.