杜仲總黃酮的提取工藝優化

(湖南省張家界市藥品檢驗所，湖南 張家界 427000)

杜仲為杜仲科杜仲屬植物，俗稱木棉、絲連皮等，原產于我國，在日本、朝鮮、緬甸亦有栽培。現代藥理研究表明，杜仲含有綠原酸、桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、黃酮類物質、地普黃內酯、多糖等活性成分，具有補肝腎、堅筋骨、降壓、抗菌、利尿、抗腫瘤、久服輕身耐老之功效。由于杜仲獨特的藥用價值和潛在的經濟價值，國內外學者對其化學成分和生物活性作了大量的研究[1]。黃酮類化合物具有降血糖、調血脂、抗菌消炎、抗氧化、抗衰老、消除體內自由基等藥理作用[2]，因此經濟、高效的黃酮提取工藝極其重要。微波是一種超高速電磁波，具有很強的穿透作用，能使植物細胞中的水分或有機溶劑迅速升溫升壓，使細胞壁穿孔，讓有效成分從細胞中溶出，而且微波電磁場能使分子運動短時間內加劇，從而縮短了提取時間，提高了提取率[3]。本試驗通過比較回流提取法、超聲提取法、微波提取法對黃酮提取率的影響，采用正交試驗法優選黃酮的最佳提取工藝?，F報道如下。

1 儀器與材料

TU－1901型紫外分光光度計(北京惠普通用儀器公司);AUW220D型電子分析天平(日本島津公司);格蘭仕WD800G型微波爐(佛山市順德微波爐電器有限公司);KQ2200型超聲波清洗機(昆山超聲儀器公司);HHS－2S型電熱恒溫水浴鍋(上海南陽儀器有限公司);QE－500型搖擺式高速萬能粉碎機(浙江省武義縣屹立工具有限公司)。杜仲(市售品);蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所);試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量測定方法(紫外分光光度法)

2.1.1 方法學考察

標準曲線繪制:精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品10 mg，用75%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，混勻。精密吸取此液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，各加 5% 亞硝酸鈉 0.3 mL，放置 6 min，再加硝酸鋁 0.3 mL，放置 6 min，加 4% 氫氧化鈉溶液2 mL，以75%乙醇稀釋至刻度，搖勻。在510 nm波長處，以空白試劑為參比測定吸光度，回歸方程為 A=11.70 C－0.004 4，r2=0.999 4(n=6)。結果表明，蘆丁對照品質量濃度在0.005～0.025 g/L范圍內與吸光度線性關系良好。

精密度試驗:取對照品溶液(0.010 2 g/L)，依法連續測定5次。結果的 RSD為0.35%(n=5)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗:精密稱取同一樣品10 g，共5份，依法測定含量。結果的 RSD為0.31%(n=5)，表明方法重復性較好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，分別于配制后0，15，30，45，60 min時依法測定。結果吸光度的 RSD為0.88%(n=5)，表明供試品溶液在60 min內穩定。

加樣回收試驗:精密取蘆丁對照品溶液(0.102 18 g/L)1.0 mL，加入到杜仲提取液中做回收試驗，重復3次。結果見表1。

表1 蘆丁加樣回收試驗結果(n=3)

2.1.2 樣品含量測定

取一定量樣品的提取液，按標準曲線繪制項下方法處理，分別用分光光度計在510 nm波長處測定吸光度，代入回歸方程，計算得總黃酮含量。

2.2 杜仲黃酮提取方法確定

稱取杜仲粉末10 g(過60目篩)，分別采用回流提取法(加60%乙醇200 mL，水浴回流60 min，過濾，提取2次，合并濾液，定容至100 mL)、超聲提取法(置500 mL錐形瓶中，加60%乙醇200 mL，室溫下超聲提取60 min，過濾，濾液定容至100 mL)、微波提取法(加60%乙醇200 mL，在微波功率200 W條件下加熱提取120 s，過濾，共提取2次，合并濾液，定容至100 mL)提取，考察提取方法。結果見表2。從總體上比較，微波提取法的提取率最高，回流提取法次之，超聲提取法最低。回流提取法由于高溫時間長，易溶出杜仲中的蛋白質、糖類等物質，須進一步提純;超聲提取時間較長，功率消耗大，提取率不高。故將微波提取法作為杜仲黃酮的提取方法。

表2 杜仲黃酮提取方法考察結果比較

2.3 微波提取工藝優化

2.3.1 正交試驗設計

微波功率主要影響升溫速度，功率越大，提取時環境溫度升得越快，相對而言，處于較高溫度的時間也越長，故提取率也較高。但功率過大易使乙醇爆沸，從而導致揮發過多;另一方面，高溫使蛋白質凝固，黃酮不易溶出。因此，微波功率以200 W為佳[4]。通過預試驗，選取影響杜仲黃酮提取率的主要因素乙醇體積分數(因素 A)、提取時間 (因素 B)、料液比(因素 C)進行 L9(34)正交試驗，因素水平見表3。

表3 因素水平表

2.3.2 試驗結果

結果見表4。直觀分析可知，微波功率為200 W時，三因素對總黃酮提取率的影響依次為A＞B＞C，即乙醇體積分數＞提取時間＞料液比。最佳工藝條件為A1B2C2，即乙醇體積分數60%，提取時間 10 min，料液比 1 ∶20。

表4 L9(34)正交試驗結果

2.3.3 工藝優化

正交試驗表明，影響總黃酮提取率最主要的因素是乙醇體積分數，其次是提取時間、料液比。因素C2與C3差異較小，考慮到料液比增加，總黃酮提取率會有不同程度的增加，為提高綜合經濟效益，將A1B2C3作為最佳提取工藝，即乙醇體積分數60%，提取時間 10 min，料液比 1 ∶30。

2.3.4 驗證試驗

為進一步考察優選工藝的可靠性及穩定性，取3份樣品，按最佳提取工藝進行驗證試驗，結果見表5。可見，該優選工藝合理可行。

表5 驗證試驗結果

3 討論

與回流提取法、超聲提取法相比，微波提取法具有高效性、強選擇性、操作簡便、活性成分得率高、產物易純化等特點，可廣泛用于各種中草藥中黃酮類化合物的提取。

試驗結果表明，杜仲總黃酮的最佳提取工藝條件為微波功率200 W，乙醇體積分數60%，提取時間10 min，料液比1∶30(此時總黃酮得率為1.97mg/g)。

[1]孫燕榮，董俊興，吳曙光.杜仲化學成分研究[J].中藥材，2003，27(5):341.

[2]莫開菊，程 超，黃 鵬，等.生姜黃酮提取純化及結構的初步鑒定[J].食品科學，2005，26(9):229.

[3]仇 燕.菜芙蓉花中總黃酮微波提取的研究[J].中藥材，2006，29(4):387.

[4]陳 偉，劉青梅，楊性民，等.微波技術在杜仲黃酮提取工藝中的應用研究[J].食品科學，2006，27(10):285.