敗醬草藥材高效液相色譜指紋圖譜鑒別研究

(上海醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系，上海 201318)

敗醬草(Herba Patriniae)是一種常用中藥，具有清熱解毒、消癰排膿之功效，臨床上用于治療多種婦科炎癥及化膿性疾病。1977年版《中國藥典》規(guī)定正品為敗醬科植物黃花敗醬 Patrinia scabiosaefolia Fisch.和白花敗醬 Patrinia villosa Juss.的干燥全草。筆者用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)這兩個(gè)品種的敗醬草進(jìn)行指紋圖譜對(duì)比研究，旨在為該藥材的品種鑒別和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

1 儀器與試藥

1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);MILI－Q型超純水儀(美國Millipore公司);Sartorius BT25S型電子天平(北京賽多利斯有限公司);Branson B3500S－DTH型超聲波清洗儀(必能信超聲上海有限公司)。異牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)品(中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，批號(hào)為1429－070320);異葒草素標(biāo)準(zhǔn)品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)為080916);磷酸、乙腈(色譜純);敗醬草(來自全國各地藥材市場(chǎng)，見表1)。

表1 敗醬草的產(chǎn)地和批號(hào)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil－C18柱(250mm×4.6mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈－0.1%磷酸，梯度洗脫(見表 2);進(jìn)樣量:5 μL;流速:0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):320 nm;柱溫:25℃ 。

2.2 溶液制備

精密稱取0.29 mg異牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)品，以1 mL甲醇溶解，得異牡荊苷對(duì)照品溶液;精密稱取異葒草素標(biāo)準(zhǔn)品0.50 mg，以1 mL甲醇超聲溶解即得異葒草素對(duì)照品溶液。稱取藥材粉末(過 40 目篩)1.0 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加50 mL甲醇，超聲處理60 min(功率 140 W，頻率42 kHz)，放冷，抽濾，用適量甲醇洗滌殘?jiān)瑸V液減壓蒸干，加甲醇定量轉(zhuǎn)入5 mL量瓶中，定容，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫表

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜。結(jié)果表明，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積無明顯變化，相對(duì)保留時(shí)間的 RSD＜1%(n=6)，相對(duì)峰面積的 RSD＜2%(n=6)，符合指紋圖譜要求，精密度良好。

2.3.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取PVJ01號(hào)藥材樣品粉末，精密稱定6份，依法制備供試品溶液，記錄指紋圖譜。結(jié)果表明，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積無明顯變化，相對(duì)保留時(shí)間的 RSD＜1%(n=6)，相對(duì)峰面積的 RSD＜4%(n=6)，符合指紋圖譜要求，重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取PVJ01號(hào)藥材樣品粉末，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別于制備后0，8，12，24 h時(shí)檢測(cè)指紋圖譜。結(jié)果表明，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積無明顯變化，相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1%，相對(duì)峰面積的 RSD＜5%，符合指紋圖譜要求，24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜建立及分析

2.4.1 共有峰確定

依法不同產(chǎn)地的敗醬藥材，比較各樣品的色譜圖，應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(國家藥典委員會(huì)，2004年版)生成對(duì)照指紋圖譜。白花敗醬有15個(gè)峰為共有峰(圖1)，其中3號(hào)峰是異牡荊苷，為參照峰;2號(hào)峰為異葒草素。黃花敗醬有10個(gè)峰為共有峰，未檢測(cè)出異牡荊苷和異葒草素。兩種藥材的指紋圖譜差異較大。

圖1 白花敗醬對(duì)照指紋圖譜

圖2 黃花敗醬對(duì)照指紋圖譜

圖3 白花敗醬與黃花敗醬的指紋圖譜

2.4.2 相似度計(jì)算

應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件，對(duì)白花敗醬和黃花敗醬的各批次藥材進(jìn)行了相似度分析。結(jié)果見表2，兩種敗醬草各批次藥材的相似性均較差;同時(shí)二者的對(duì)照?qǐng)D譜相似度僅為0.021，提示二者在物質(zhì)基礎(chǔ)上有較大差異。

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中擬采用不同的樣品制備方法，以優(yōu)化樣品色譜圖。但討論后認(rèn)為，首次研究敗醬草指紋圖譜，由于仍不確定其活性部位，不宜只以某一部位為主，不宜過度純化樣品，否則會(huì)失去樣品的整體性。經(jīng)過考察，發(fā)現(xiàn)甲醇作為提取溶劑色譜峰最多，響應(yīng)最高，有利于指紋鑒別，因此選擇甲醇作為提取白花敗醬的提取溶劑。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，白花敗醬和黃花敗醬物質(zhì)基礎(chǔ)相差較大，而目前藥材標(biāo)準(zhǔn)中均作為敗醬草的法定藥材，因此考慮采用統(tǒng)一指紋條件對(duì)其進(jìn)行分辨。采用210 nm波長(zhǎng)雖然對(duì)白花敗醬較為適宜，但對(duì)黃花敗醬不適用，難以統(tǒng)一色譜條件，而在320 nm波長(zhǎng)下二者均可以達(dá)到較好分離，利于采用統(tǒng)一色譜條件對(duì)其進(jìn)行指紋分析，故選擇320 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在參照物的選擇上，難以找到二者共有的成分作為參照物，故以白花敗醬中含量最高、分離度最好的異牡荊苷和異葒草素作為參照物。

表2 白花敗醬和黃花敗醬20批藥材相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

用高效液相色譜法對(duì)法定的兩種敗醬草藥材進(jìn)行指紋圖譜對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)二者在物質(zhì)基礎(chǔ)上具有較大差異，這就對(duì)臨床上將這兩種藥材作為一種中藥來使用的合理性提出了質(zhì)疑。據(jù)本草考證，《神農(nóng)本草經(jīng)》中最早記載的是黃花敗醬，而白花敗醬記載于明代醫(yī)學(xué)家李時(shí)珍編著的《本草綱目》[1－2]，兩種藥材的入藥時(shí)間相差久遠(yuǎn)，功能主治也有所不同，《本經(jīng)》記載“主暴熱火創(chuàng)，赤氣，疥搔，疸痔，馬鞍，熱氣”，《綱目》記載“敗醬，善排膿破血，故仲景治癰，及古方婦人科皆用之”，似乎后者用途更接近現(xiàn)今敗醬草的臨床用途。本研究結(jié)果提示，這兩種藥材作為一種中藥使用值得商榷，需要在今后的工作中對(duì)其藥理學(xué)和臨床學(xué)進(jìn)行更為深入的研究。

[1]盧寅熹.敗醬草的本草考證[J].時(shí)珍國藥研究，1996，7(3):129－130.

[2]楊學(xué)浩.敗醬草的品種鑒別和應(yīng)用[J].山西中醫(yī)，2005，21(6):44.