運動性損傷后大鼠骨骼肌轉化生長因子-β1變化的研究

于新凱，石鵬超，左 群

骨骼肌損傷修復是一個極其復雜的過程，多年來一直將骨骼肌細胞視為終末分化細胞，但是，衛星細胞的發現推動了骨骼肌再生研究的飛速發展。衛星細胞是位于肌膜與基底膜之間的一組細胞群，是肌肉損傷后修復的惟一來源，其修復伴隨著復雜的生物學調節機制，與大量的生長因子相關，生長因子是一類影響細胞生長活性的多肽因子，其對刺激衛星細胞增殖和分化，促進組織或器官修復和再生具有重要作用[16]。轉化生長因子-β（Transforming Grow th Factor-β，TGF-β）是一種多功能的細胞生長因子，分布于各類型的細胞和組織中，它不僅影響胚胎發育、骨的形成、血管再生、炎癥反應和組織修復，而且，對細胞的生長、分化、凋亡和免疫功能也有重要的調節作用[8]。哺乳動物體內TGF-β共有3種亞型：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中，TGF-β1所占比例最高（＞90％），活性最強[2]。目前研究認為，TGF-β可以影響骨骼肌損傷修復的生長因子，在衛星細胞增殖和分化過程中起負性調節作用[13，18，20]。

但已有的研究大多集中于觀察離體細胞培養過程中TGF-β的作用和變化，在體研究較少。本研究擬通過建立運動性骨骼肌損傷實驗動物模型，觀察損傷后不同時刻肌肉內 TGF-β1的變化，研究骨骼肌損傷修復過程中 TGF-β1的變化特征，從而進一步探究骨骼肌損傷后的修復過程，豐富運動性骨骼肌損傷修復理論。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

8周齡雄性SD大鼠72只，購于上海西普爾—必凱實驗動物有限公司，體重264.44±11.94 g，分籠飼養，室溫20℃±2℃，相對濕度50％～55％，光照時間12 h，國家標準嚙齒類動物固體干燥飼料喂養，自由飲食。大鼠經過跑臺適應訓練后按體重隨機分為對照組（C組）、運動后即刻組、6 h組、12 h組、24 h組、48 h組、72 h組、1周組、2周組。

1.2 運動損傷模型和實驗取材

除C組外，其余各組大鼠進行一次90 min持續跑臺訓練，速度為16 m/min，坡度為-16°，分別在運動后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、1周、2周等不同時刻處死、取材。

大鼠采用10％水合氯醛淺麻后，迅速取雙側腓腸肌，左側腓腸肌液氮速凍后置于-80℃低溫冰箱保存待用，用于RT-PCR分析；右側腓腸肌置于4％多聚甲醛固定液中固定，制作石蠟切片，進行 HE和免疫組織化學染色。

1.3 TGF-β1m RNA的RT-PCR測定

取凍存左側腓腸肌置于玻璃勻漿器中，加1 m l Trizol，充分勻漿，靜至5 min后，取上清移至1.5 m l Eppendo rf管，室溫放置 10 min，加 200μl氯仿，充分混勻， 15 000 rpm離心5～7 min，取上清至1.5 m l Eppendorf管加600μl氯仿混勻，15 000 rpm離心5 min；取上清至1.5 m l Eppendo rf管加500μl異丙醇混勻，15 000 rpm離心10 min，棄上清，用75％乙醇1 m l沖洗，高速離心5 min，棄上清，RNA沉淀于空氣中干燥（2～3 min）；將干燥后的RNA溶解于DEPC處理水中，將總RNA作適當稀釋后，分光光度計測OD 260/OD 280比值，并定量。定量公式：RNA濃度（μg/m l）=OD 260值×40×稀釋倍數（400倍）。

按下列順序在1.5 m l離心管中加入下列反應物（體積為12.5μl）：DEPC水6μl、RNA酶抑制劑（50 U/μl） 0.5μl、隨機引物（50 pM/μl）2μl、RNA（2μg），在65℃水浴處理5 min后室溫放置10 min，高速離心5 s，按下列順序加在1.5 m l離心管加入下列反應物（總體積為20 μl）：RNA酶抑制劑（50U/μl）0.5μl、5×buffer（Promega） 4μl、dN TP M IX（10mM/each）2μl、DTT2μl、M-MLV （200 U/μl）1μl，水浴37℃下反應1 h，90℃處理 5～10 min后冰浴5 min，高速離心5 s。

PCR反應體系（50μl）：H2O：34.5μl，MgCl2（TaKa-Ra）5μl，10×buffer（TaKaRa）、dNTP（10mM/each）、Primer（up50 pM/ul）、Primer（dow n50 pM/μl）各 1μl， Temp late（反轉錄產物，即cDNA）2μl，Taq（5U/μl）0.6 μl（3 U）。反應條件：95℃2 min，94℃30s、60℃45s、72℃1 min，共38個循環，72℃6 min。內參選用 GAPDH。

表1 引物序列、產物長度一覽表

產物電泳和分析：TBE緩沖液，1.2％的瓊脂糖電泳，電壓為160 V，55 min，利用系列數碼凝膠圖象處理系統GIS-2008和圖象分析軟件分析。

1.4 腓腸肌 HE染色

將右側腓腸肌后固定24 h以上后，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，制作石蠟切片，切片厚度為5μm。

將切片脫蠟至水，浸入蘇木素中染色5 min，自來水沖洗3 min，1％稀鹽酸酒精分化2～3 s，自來水沖洗3 min，伊紅染色3 min，流水沖洗3 min，脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察腓腸肌細胞形態結構，拍照并采集圖像。

1.5 TGF-β1免疫組化染色和圖像采集

切片常規脫蠟至水，3％H2O2室溫孵育20 min，PBS （p H 7.4）洗3次，每次2 min；PBS（p H 7.0）抗原熱修復， PBS（p H 7.4）洗1次5 min；滴加5％山羊血清封閉液，室溫孵育20 min；滴加一抗，4℃濕盒孵育過夜，PBS（p H 7.4）洗3次，每次5 min；滴加二抗，37℃濕盒孵育20 min，PBS （p H 7.4）洗4次，每次5 min；滴加 SABC，37℃濕盒孵育20 min；DAB顯色；蘇木精輕度復染，鏡檢，拍照并采集圖像。

隨機抽取每組大鼠腓腸肌 TGF-β1免疫組織化學反應染色切片，每組5張。采用光學顯微鏡Olympus DX70和Image-Pro Plus 4.1圖像分析軟件進行圖像采集和分析處理。每張切片隨機各取5個視野，每組共測25個視野，在同一放大倍數下測定免疫陽性表達面積和積分光密度（Integrated Optical Density，IOD）。

1.6 數據統計

2 研究結果

2.1 各組大鼠腓腸肌TGF-β1mRNA RT-PCR結果

表2顯示，一次下坡跑后大鼠腓腸肌 TGF-β1mRNA除72 h組外，其余各組均低于對照組，其中24 h和2周組顯著性低于對照組（P＜0.05），其余均與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠腓腸肌TGF-β1m RNA表達水平一覽表

2.2 各組大鼠腓腸肌 HE染色結果

圖1 各組大鼠腓腸肌HE染色結果圖 ×400

HE染色可見，C組肌膜完整、清晰，肌纖維結構正常； 0 h組肌纖維略腫脹，肌纖維形態無明顯變化；6 h組肌纖維腫脹明顯，部分肌纖維呈圓形；12 h組肌纖維持續腫脹，部分肌纖維溶解，肌膜模糊，不連續；24 h組肌纖維部分斷裂，有少量炎癥細胞浸潤；48 h組炎癥細胞明顯增多；72 h組大量炎癥細胞浸潤；1周組偶見炎癥細胞浸潤，肌纖維無明顯腫脹；2周組肌纖維形態結構基本正常，肌膜完整性良好（圖1）。

2.3 各組大鼠腓腸肌 TGF-β1免疫組織化學結果

表3 各組大鼠腓腸肌TGF-β1免疫組化圖像采集分析結果一覽表

免疫組化染色結果可見，對照組和實驗組大鼠腓腸肌TGF-β1染色均為陽性，棕褐色或棕黃色的顆粒主要分布在細胞質。經蘇木精復染后，細胞核被染成淡藍色，細胞質和其他部位不著色，用PBS代替一抗的相鄰陰性對照切片細胞質內無陽性表達結果（圖2）。

表3、圖2的免疫組化結果顯示，與C組相比，0 h組、6 h組、72 h組、2周組 TGF-β1免疫陽性染色面積減少，積分光密度值降低，差異具有顯著性（P＜0.05）；12 h組、24 h組、48 h組、1周組的陽性染色面積減少，積分光密度值降低，差異不具有顯著性（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠腓腸肌 TGF-β1免疫組織化學結果圖 ×1 000

3 討論

運動性骨骼肌損傷是一種高強度和/或長時間運動后發生的骨骼肌損傷。研究表明，人體在經歷一次劇烈且不習慣的運動后肌肉會出現肌力下降、運動范圍減小、肌肉酸痛等一系列現象，并且這些現象在第一次離心運動后表現更加明顯。本研究的首要目的是準確建立運動性損傷的動物模型，基于此我們采用了經典的A rmstrong下坡跑運動模型，在運動時間和動物分組方面做了一定的調整。

通過 HE染色結果發現，運動后即刻大鼠腓腸肌肌纖維出現腫脹趨勢；6 h組肌纖維發生明顯腫脹現象，部分肌細胞呈圓形，面積增加，且局部可見細胞核增多，這表明骨骼肌損傷已經發生；12 h～72 h時間段內肌纖維持續腫脹，肌纖維細胞核增多，局部肌纖維橫紋模糊，肌纖維邊緣不清，大量炎癥細胞浸潤，偶見小片狀肌纖維溶解等現象；損傷發生1周后肌纖維形態結構趨于正常；2周后，可見肌纖維形態基本恢復正常。形態學觀察可看出，本實驗動物模型基本上反映了運動性骨骼肌損傷修復的全過程。

一般認為，骨骼肌損傷后，衛星細胞即被激活，開始肌肉再生過程。衛星細胞的增殖和分化受到正性和負性兩類生長因子的調控，骨骼肌損傷發生后，各類生長因子通過整體協同效應調節骨骼肌再生修復。

胰島素樣生長因子（IGF），生肌決定因子（M yoD），堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），肝細胞生長因子（HGF）等是典型的正性調節因子。動物實驗也表明骨骼肌損傷后，影響衛星細胞增殖和分化的正性調節因子有很高的表達：李宏云等[1]在骨骼肌鈍挫傷后發現 IGF-ImRNA表達明顯升高；肖衛華等[4]報道，小鼠腓腸肌鈍挫傷后，1～7天內MGFmRNA表達水平持續升高，第11天時仍明顯高于對照組；向崢等[3]發現，bFGFmRNA在運動性骨骼肌損傷中明顯升高；Tatsumi[22]發現骨骼肌損傷后，衛星細胞很快被激活，HGF表達明顯增加。

TGF-β則是影響衛星細胞增殖和分化的負性調節因子，Ronald E Allen[20]對成熟大鼠骨骼肌衛星細胞體外培養實驗中發現，TGF-β可以同時抑制衛星細胞的增殖和分化，而衛星細胞的分化受 TGF-β濃度影響較其增殖更為敏感，表現為較低濃度的 TGF-β即可對衛星細胞的分化產生明顯抑制效應。Marcia R Hathaway等[18]研究也發現，0.05～0.3 ng/ml的 TGF-β1可以對豬和牛的衛星細胞增殖產生明顯的抑制效應。此外也有研究發現，TGF-β1的生物學效應受到其他生長因子的影響。Douglas R Cook[13]在研究中觀察到，TGF-β1單獨使用可以抑制豬衛星細胞的增殖，而 TGF-β1和FGF，IGF-I聯合使用則可以促進豬衛星細胞的增殖；國內學者黎煒英等[2]也發現，bFGF和 TGF2β聯合作用對體外培養骨骼肌衛星細胞的增殖起了重要作用。在骨骼肌疾病和損傷中，TGF-β對結締組織增殖和纖維化起決定性作用，以往對 TGF-β的研究以體外細胞培養，TGF-β與器官的纖維化等為主，而對 TGF-β在運動性骨骼肌損傷中作用和變化的研究較少。

本研究對骨骼肌損傷修復過程中 TGF-β1轉錄水平和翻譯水平的表達進行了綜合研究和分析。RT-PCR結果顯示，在運動后各組中除72h組外其余各組TGF-β1mRNA表達水平均低于對照組；免疫組化染色結果顯示，TGF-β1陽性為棕褐色或棕黃色顆粒，主要分布在細胞質內，與前人研究結果[9]是一致的，與對照組相比，運動后各組蛋白表達量均下降。結果提示，盡管 TGF-β1在轉錄和翻譯水平的表達變化不完全一致，但整體都較對照組呈下降趨勢，說明 TGF-β1的表達在骨骼肌損傷修復過程中受到明顯抑制。對照組中TGF-β1mRNA和蛋白均有一定的基礎表達，這說明 TGF-β1在維持機體正常功能和形態方面可能是不可缺少的。

正常生理狀態下衛星細胞處于靜息狀態，肌肉損傷時被激活進入分裂期，不斷增殖，融合為肌管，最后分化為成熟的肌纖維[7]。一般認為，衛星細胞在損傷后2～3天內廣泛增殖，在損傷發生3天以后衛星細胞退出細胞周期，或自我更新，或開始分化形成具有中央細胞核的肌管[14，17，19，21]。

本研究中一次下坡跑后0～72 h免疫組化結果顯示， TGF-β1表達水平較對照組呈下降趨勢，該時間段內骨骼肌衛星細胞主要處于活躍的增殖期，運動后即刻 TGF-β1蛋白的表達迅速下降超過1/3，反映了在運動性骨骼肌損傷后TGF-β1的表達是受到明顯抑制的，TGF-β1mRNA的表達情況類似：各組的表達大多降低，其低值出現在運動后24 h，表達量不足對照組的一半，TGF-β1的低水平表達，可能與 TGF-β1受到其他正性調節因子的抑制效應有關，本課題組的另外研究發現，在該時間段內調節衛星細胞增殖的正性調節因子水平較對照組明顯升高。此外， TGF-β1蛋白表達的迅速下降也可能與運動損傷引起TGF-β1外漏有關。作為一種小分子的蛋白多肽，TGF-β1在肌纖維損傷后，由于細胞膜通透性增強很容易外漏進入其他組織和血液中。Czarkow ska-Paczek B采用酶聯免疫法檢測血清內的 TGF-β1，研究發現一次急性運動后人體血清內 TGF-β1表達水平上升[12]。與此相似，Hering S等[15]研究也發現，4周的運動訓練過程中，2周內血清內的TGF-β1水平明顯升高，3～4周 TGF-β1水平持續下降。

骨骼肌損傷72 h后即炎癥反應后期，此時衛星細胞開始分化。本研究中骨骼肌損傷1周后，肌纖維形態結構趨于正常，2周后形態基本恢復正常，骨骼肌再生修復應進入后期。但此時TGF-β1mRNA表達水平和蛋白表達水平均明顯低于對照組（P＜0.05），據此推測此時衛星細胞可能仍處于分化融合階段，損傷修復尚未完全完成，仍在進行中，TGF-β1依然受到抑制，其具體機制仍有待于進一步研究。

TGF-β在骨骼肌再生修復過程中的高表達可能會影響修復的進行并造成纖維化[10]。研究人類馬方綜合癥（MFS）疾病小鼠動物模型實驗中，缺少原纖維蛋白Ⅰ的小鼠體內TGF-β的活性明顯增強，TGF-β活性增強抑制了骨骼肌再生[10]。另有報道稱[6、23]，在杜氏肌營養不良的病人肌肉內，TGF-β1有很高的表達，并且 TGF-β1與纖維化的形成密切相關。該作者認為，肌營養不良發生后，肌肉開始變性，緊接著是肌肉逐漸壞死，炎癥反應發生在壞死的區域，局部病灶釋放 TGF-β1，并通過激活細胞外基質和結締組織的增生，從而引起纖維化。Amemiya K[5]和Confalonieri P[11]在皮膚炎病人的肌肉活檢標本中，觀察到了過量的TGF-β1，他們認為過量的 TGF-β1導致慢性炎癥，纖維化和細胞外基質的累積。

上述研究的共同特征是骨骼肌損傷或變性較嚴重，肌肉壞死和炎癥反應明顯，在肌肉損傷后數天非常活躍，肌肉再生發生在損傷后7～10天內，再生過程在2周內達到高峰，在肌肉損傷后3～4周開始減慢，疤痕組織即纖維化的形成在損傷后2～3周內發生[16]。

骨骼肌再生所需的時間以及修復情況與損傷的嚴重程度有關，如果損傷較輕，肌纖維膜完整，則損傷在1～2周內可以愈合，如果損傷嚴重，則損傷后3周才可以愈合，并伴有疤痕組織形成?？梢娪捎趽p傷程度的不同造成兩種不同的修復結果：完全再生和瘢痕（或部分瘢痕）修復。本實驗通過形態學觀察可見：2周組腓腸肌肌膜完整性良好，肌纖維形態結構基本恢復正常，未見纖維化和瘢痕組織形成，這表明本實驗骨骼肌損傷后可以實現完全再生，該損傷仍應屬于“微損傷”的范疇，不同于以上研究。

4 小結

1.一次下坡跑運動能夠明顯引起運動性骨骼肌損傷，骨骼肌損傷發生2周后基本恢復正常，且未見纖維化形成。

2.骨骼肌損傷修復過程中 TGF-β1的表達整體呈下降趨勢，生物活性受到明顯抑制。

[1]李宏云，陳世益，陳疾忤，等.注射攜人IGF-1基因的成肌細胞對小鼠損傷骨骼肌內源性m IGF-1表達的影響[J].中國運動醫學雜志，2008，27（5）：584-587.

[2]黎煒英，朱衛雄，劉丹.bFGF、TGF2β聯合使用對大鼠骨骼肌衛星細胞增殖能力的影響.[J].武漢大學學報（醫學版），2007，28 （6）：733-736.

[3]向崢，孫林輝，余斌.堿性成纖維細胞生長因子mRNA在運動性肌損傷骨骼肌中的表達[J].華南國防醫學雜志，2007，21（3）： 28-30.

[4]肖衛華，陸耀飛.骨骼肌損傷后修復過程中機械生長因子作用研究[J].體育科學，2008，28（6）：34-38.

[5]AMEM IYA K，SEM INO-MORA C，GRANGER RP，etal. Dow nregulation of TGF-beta 1 mRNA and p rotein in the muscles of patients w ith inflammato ry myopathies after treatment with high-dose intravenous immunoglobulin[J].Clin Immunol 2000，94：99-104.

[6]BERNASCON IP，TORCH IANA E，CONFALON IERIP，etal. Exp ression of transforming grow th factor-beta 1 in dystrophic patient muscles correlates withflbrosis.Pathogenetic role of aflbrogenic cytokine[J].J Clin Invest，1995，96：1137-1144.

[7]BRUNO P，M ICHAEL R，YVAN T，etal.Stem and p rogenitor cells in skeletal muscle development，maintenance，and therapy [J].Mol Ther，2007，15（5）：867-77.

[8]BYRON J FALER，ROBYN A，DAHL IA PLUMM ER，etal. Transforming grow th factor-βand wound healing[J].Perspect Vascular Surgery Endovascular Therapy，2006，18：55-62.

[9]CHERYL A S，FRANCIOSE S，CHRISTOPHER W，etal. Transforming grow th factor-βfollowing skeletal muscle strain injury in rats[J].J App l Physiol，2007，102：755-761.

[10]COHN R D，VAN C E，HABASHIJ P，etal.Angiotensin II type 1 recep tor blockade attenuates TGF-beta-induced failure of muscle regeneration in multiple myopathic states[J].Nat Med，2007，13：204-210.

[11]CONFALON IERI P，BERNASCON I P，CORNEL IO F，etal. Transforming grow th factor-beta 1 in polymyositis and dermatomyositis correlates w ith fibrosis but not with mononuclear cell infiltrate[J].JNeuropathol Exp Neurol，1997，56：479-484. [12]CZARKOWSKA-PACZEK B，BARTLOM IEJCZYK I，PRZYBYLSKIJ.The serum levels of grow th factors：PDGF，TGF-beta and VEGF are increased after strenuous physical exercise [J].J Physiol Pharmacol，2006，57：189-197.

[13]DOUGLAS R COOK，MA TTEW E DOUM IT，ROBERT A MERKEL.Transforming grow th factor-beta，basic fibroblast grow th factor，and platelet-derived grow th factor-BB interact to affect p roliferation of clonally derived porcine satellite cells [J].J Cellular Physiol，1993，157：307-312.

[14]GREGORY R A.Satellite cell p roliferation and skeletalmuscle hypertrophy[J].Appl Physiol Nut Metab，2006，31：782-790.

[15]HERING S，JOST C，SCHULZ H，etal.Circulating transfo rming grow th facto rβ1（TGFβ1）is elevated by extensive exercise[J].Eur J App l Physiol，2002，86：406-410.

[16]JOHNN Y HUARD，YONG L I，FREDD IE H F U.M uscle injuries and repair current trends in research[J].J Bone Joint Surg Am，2002，84：822-832.

[17]JUDY E A，ASHLEY C W.Satellite cell activation on fibers： modeling events in vivo-an invited review[J].Can J Physiol Pharmacol，2004，82：300-310.

[18]MARCIA R H，JR HEMBREE，MARY S PAMPUSCH，etal. Effect of transforming grow th factor beta-1 on ovine satellite cell p roliferation and fusion[J].J Cellular Physiology，1990， 146：435-444.

[19]N ICOLAS F，MALGORZA TA D，CHRISTOPHE M，etal. M uscle stem cells and model system s fo r their investigation [J].Developmental Dynamics，2007，236：3332-3342.

[20]RONALD E.A IIEN，L INDA K.BOXHORN.Inhibition of skeletal muscle satellite cell differentiation by transforming grow th factor-beta[J].J Cellular Physiol，1987，133：567-572.

[21]SH IX Z，DANM IEL J G.Muscle stem cells in development，regeneration，and disease[J].Genes Dev，2006，20：1692-1708.

[22]TA TSUM IR，ANDERSON J E，NEVORET C J，etal.HGF/ SF is p resent in normal adult skeletal muscle and is capable of activating satellite cells[J].Dev Biol，1998，（194）：114-128.

[23]YAMAZA KIM，M INOTA S，SAKURA I H，etal.Exp ression of transforming grow th factor-beta 1 and its relation to endomysial fibrosis in p rogressive muscular dystrophy[J].Am J Pathol，1994，14：221-226.