腦清噴鼻微乳含藥血清對(duì)PC12細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用*

陳 穎，陳英梅，祝維峰，郭潔文，楊 帆

缺血性腦卒中是由于腦血流供應(yīng)障礙引起缺血、缺氧，導(dǎo)致局限性腦組織缺血性壞死或腦軟化的疾病，而腦缺血再灌注損傷是引發(fā)多種腦血管疾病的重要病理生理機(jī)制，而有效的治療方法為抗腦缺血再灌注損傷。我國(guó)使用中草藥防治腦血管疾病由來(lái)已久，但是傳統(tǒng)的中藥口服給藥途徑很大程度上限制了中藥療效的充分發(fā)揮，尤其對(duì)中風(fēng)吞咽困難或神志不清者，口服給藥則更為困難。中藥?kù)o脈注射液由于制劑工藝復(fù)雜，有效成分提取難度大，以致其品種和數(shù)量有限，難以滿足臨床需要。而傳統(tǒng)的中醫(yī)鼻藥療法，具有簡(jiǎn)便、實(shí)用、無(wú)創(chuàng)、安全、用藥少、速效、高效的特點(diǎn)。腦清噴鼻微乳的處方是由廣州市中醫(yī)院祝維峰教授積多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制出的治療缺血性中風(fēng)復(fù)方中藥。本文應(yīng)用血清藥理學(xué)方法對(duì)腦清噴鼻微乳進(jìn)行了研究［1］，采用谷氨酸和物理缺氧對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行損傷建立缺氧模型，比較微乳與傳統(tǒng)水提制劑以及鼻腔與灌胃不同給藥途徑得出的血清對(duì)損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與儀器

SD大鼠250g～300g，中山醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào) SCXK(粵)2008-0020，粵監(jiān)證字2008A002);大鼠的腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞，中山醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(Gibco公司);胰酶(Amresco公司);谷氨酸(康龍生物有限公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司);乳酸脫氫酶試劑盒(LDH試劑盒，南京建成生物工程研究所);腦清噴鼻微乳(自制，含生藥 1g/ml);空白微乳(自制，Cremophor EL:乙醇:水=10:10:80);尼莫地平注射液(山東新華制藥股份有限公司，批號(hào)0808176);其他試劑均為分析純。

二氧化碳培養(yǎng)箱(Heraeus細(xì)胞培養(yǎng)箱);LEICA DFC420倒置顯微鏡(LEICA);M450型ELISA Reader酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)

PC12細(xì)胞凍存于液氮中，用時(shí)進(jìn)行復(fù)蘇。培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液，含5%胎牛血清，用NaHCO3調(diào)至p H7.2左右。在37℃ 5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底后倒掉培養(yǎng)液，用PBS液輕輕蕩洗1～2次，加入0.25%的胰蛋白酶液，消化2min～3 min吸棄消化液，加入 DMEM培養(yǎng)液終止消化，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞分散開，倒置顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)。然后用DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋為5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板(100μl/孔)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層即可用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 含藥血清的制備

健康SD大鼠30只，適應(yīng)飼養(yǎng)1周，將動(dòng)物隨機(jī)分成10組。

灌胃給藥組分為腦清噴鼻微乳高、中、低劑量組及水提液組和模型組。腦清噴鼻微乳高、中、低劑量組給藥劑量分別為20、10、5 ml/kg，相當(dāng)于臨床給藥劑量的15、7.5、3.8倍等效劑量;水提液組給藥劑量為20 ml/kg，相當(dāng)于臨床給藥劑量的7.5倍等效劑量;空白微乳對(duì)照組給予等體積的空白微乳;模型組給予等體積的生理鹽水。灌胃給藥，每日早晚各1次，間隔12h，連續(xù)給藥3d。

鼻腔給藥組分為腦清噴鼻微乳組，給藥劑量為20ml/kg，相當(dāng)于臨床給藥劑量的40倍等效劑量;水提液組給藥劑量為20ml/kg，相當(dāng)于臨床給藥劑量的40倍等效劑量;空白微乳對(duì)照組給予等體積的空白微乳;模型組給予等體積的生理鹽水，8h持續(xù)給藥。以上各組于末次給藥1h后乙醚麻醉，頸動(dòng)脈取全血，室溫放置1h，離心10min(3000r/min)，小心分離血清，于56℃ 30min滅活，經(jīng)0.22μm濾膜濾過(guò)除菌，－20℃保存。

2.3 分組與給藥方法

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 PC12細(xì)胞以1×105/孔密度接種于96孔板，37℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)的PC12細(xì)胞分別處理:①正常對(duì)照組:DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，不做損傷處理;②谷氨酸損傷模型組:在預(yù)處理的細(xì)胞中加入終濃度為20mmol/L的谷氨酸，繼續(xù)培養(yǎng) 24h［2］;③缺氧復(fù)氧損傷組:將預(yù)處理的細(xì)胞置密閉玻璃干燥器中，真空泵抽真空(－0.01MPa)，保持抽取30min直至抽完培養(yǎng)基中的溶解氧，然后緩慢充入95%N2及5%CO2混合氣，直至恢復(fù)正常氣壓(干燥器中放置氣囊指示裝置)，置37℃孵育12h取出，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 12h，即缺氧 12h，復(fù)氧 12h［3］;④含藥血清保護(hù)組:用2.2項(xiàng)下制備的8組含藥血清，以10%含藥血清預(yù)處理1 h后，分別進(jìn)行②與③項(xiàng)的損傷處理，陽(yáng)性對(duì)照尼莫地平組與空白微乳組平行進(jìn)行②與③項(xiàng)的損傷處理，對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 將經(jīng)過(guò)2.3處理的PC12細(xì)胞，置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.4.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將經(jīng)過(guò)2.3處理的PC12細(xì)胞，每孔加入MTT(5mg/ml)10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄上清，每孔加入DMSO150μl振蕩10 min，溶解細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶物，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處吸光度值(A值)，計(jì)算細(xì)胞存活率%=(實(shí)驗(yàn)組A值－空白對(duì)照組A值)/(對(duì)照組A值－空白對(duì)照組A值)×100%，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。采用SPSS17.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)方法處理。

2.4.3 乳酸脫氫酶(LDH)活性測(cè)定 經(jīng)過(guò)2.3處理后，收集培養(yǎng)上清液，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)的活性，LDH漏出率按下式計(jì)算:LDH漏出率(%)=各組吸光值/模型組吸光值×100%。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

圖1顯示，正常對(duì)照組 PC12細(xì)胞呈梭形或多角形，有小的短突起，細(xì)胞數(shù)量多。谷氨酸和物理缺氧損傷組細(xì)胞數(shù)量顯著減少，大量細(xì)胞受損，細(xì)胞突起回縮，呈圓形，漂浮細(xì)胞較多。含藥血清保護(hù)組細(xì)胞數(shù)量較多，且隨著給藥濃度的增加，細(xì)胞存活率趨高，接近正常對(duì)照組，細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)正常，圓形及漂浮細(xì)胞減少，說(shuō)明含藥血清對(duì)PC12細(xì)胞的損傷有較好的保護(hù)作用。正常對(duì)照組、損傷組、含藥血清保護(hù)組細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 顯微鏡下PC12細(xì)胞形態(tài)(×100)

3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

表1顯示，腦清噴鼻微乳和傳統(tǒng)水提液的含藥血清對(duì)PC12細(xì)胞的谷氨酸和物理缺氧損傷模型都有保護(hù)作用。其中，灌胃給藥3個(gè)劑量組的含藥血清對(duì)損傷模型有明顯的保護(hù)作用并呈現(xiàn)出劑量依賴性，而灌胃給藥和鼻腔給藥的含藥血清對(duì)損傷模型的保護(hù)作用相當(dāng);而且無(wú)論是灌胃給藥還是鼻腔給藥，結(jié)果均顯示腦清噴鼻微乳的含藥血清比水提液的含藥血清保護(hù)效果好(P＜0.05)。

表1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率結(jié)果(珋x±s，n=3)

3.3 LDH的漏出量檢測(cè)

表2顯示，腦清噴鼻微乳和傳統(tǒng)水提液的含藥血清都抑制了細(xì)胞LDH的釋放，說(shuō)明對(duì)PC12細(xì)胞的谷氨酸和物理缺氧損傷模型都有保護(hù)作用。其中，灌胃給藥3個(gè)劑量的含藥血清對(duì)損傷模型有明顯的保護(hù)作用并呈現(xiàn)出劑量依賴性，而灌胃給藥和鼻腔給藥的含藥血清對(duì)損傷模型的保護(hù)作用相當(dāng);無(wú)論是灌胃給藥還是鼻腔給藥，結(jié)果都顯示腦清噴鼻微乳的含藥血清比水提液的含藥血清保護(hù)效果好。

表2 LDH漏出量檢測(cè)結(jié)果(珋x±s，n=3)

4 討論

中藥的研發(fā)主要是尋找藥物的有效成分或有效部位，制備精良的中藥制劑，提高臨床療效和降低毒副作用。血清藥理學(xué)可以對(duì)有效藥物或藥物的有效成分進(jìn)行初步篩選，還可以對(duì)藥物的制劑工藝進(jìn)行比較和篩選等。腦清噴鼻微乳方劑是以麝香、冰片芳香開竅為君，配伍石菖蒲、川芎、三七為臣，以加強(qiáng)麝香、冰片開竅醒神之效，并有行氣活血、化痰息風(fēng)之功。薄荷芳香走竄，載藥上行為佐使，全方合用，量小力專，符合治療缺血性中風(fēng)病理機(jī)制與治療要求，經(jīng)過(guò)多年臨床應(yīng)用證明其療效可靠。結(jié)合微乳本身固有的特殊結(jié)構(gòu)將其制成的鼻腔給藥制劑，可以增加藥物的溶解度，促進(jìn)藥物吸收，提高藥物的生物利用度，可為腦部疾病的治療提供新給藥途徑。用含藥血清代替煎劑或粗提物進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，克服了將中藥復(fù)方制劑直接用于體外實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)，通過(guò)依照制劑的臨床給藥途徑獲取的含藥血清在體外的藥理效應(yīng)來(lái)反映藥物在機(jī)體內(nèi)的作用，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性，能較客觀和真實(shí)地闡明中藥的藥效和作用機(jī)理。

有關(guān)缺氧誘導(dǎo)凋亡模型的建立有較多文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用谷氨酸和物理缺氧對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行損傷，建立缺氧模型。谷氨酸可通過(guò)多種機(jī)制引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣失衡，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡［4］。神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣增多，可激活蛋白激酶和磷脂酶產(chǎn)生自由基，造成細(xì)胞損傷。國(guó)外很多報(bào)道證明，谷氨酸對(duì)PC12細(xì)胞的毒性包括氧化毒性［5、6］。另外，物理缺氧模型不改變細(xì)胞培養(yǎng)基成分的條件，更能真實(shí)模擬體內(nèi)缺氧情況，更好地體現(xiàn)藥物的保護(hù)作用。

MTT比色法是測(cè)定細(xì)胞活力常用的方法，MTT指標(biāo)能反映細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，缺氧復(fù)氧組MTT值的下降是細(xì)胞內(nèi)氧化壓力上升的一種體現(xiàn)，并與出現(xiàn)的細(xì)胞死亡相關(guān)。細(xì)胞死亡或損傷時(shí)LDH釋放至培養(yǎng)上清液中，上清液 LDH水平反映了細(xì)胞的損傷程度。PC12細(xì)胞缺氧復(fù)氧培養(yǎng)或谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷后，細(xì)胞活力明顯下降，細(xì)胞損傷程度大;而應(yīng)用含藥血清預(yù)處理可明顯增加細(xì)胞活力，細(xì)胞損傷程度明顯降低。

本實(shí)驗(yàn)證明，大鼠給予不同劑量腦清噴鼻微乳所得的含藥血清對(duì)缺氧復(fù)氧損傷模型有明顯的保護(hù)作用并呈現(xiàn)出劑量依賴性，而微乳制劑比傳統(tǒng)水提制劑的藥效更好。MTT數(shù)據(jù)顯示，灌胃3.8倍給藥組保護(hù)作用最強(qiáng)，陽(yáng)性對(duì)照尼莫地平組其次，微乳鼻腔給藥組僅次于前二者。LDH數(shù)據(jù)顯示，微乳鼻腔給藥組與灌胃3.8倍給藥組結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，腦清噴鼻微乳可經(jīng)鼻黏膜吸收入血而發(fā)揮治療作用，而且可避開首過(guò)效應(yīng)，直接到達(dá)病灶發(fā)揮作用，為開發(fā)療效好、不良反應(yīng)少的缺血性腦中風(fēng)天然藥物新制劑奠定了基礎(chǔ)。

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