化瘀泄濁方對腎間質纖維化實驗大鼠整合素連接激酶的影響*

王彥凱，潘利敏，王鳳麗，李林林，袁國棟，王月華

慢性腎臟病患者腎間質纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)的嚴重程度較腎小球病變更為重要［1］。腎小管上皮細胞轉分化(renal tubular epithelial to mesenchymal transition，EMT)在 TIF發生發展中具有重 要 作 用［2］。 轉 化 生 長 因 子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前所公認的導致腎臟纖維化的重要因子，在 TGF-β誘導的 EMT過程中整合素連接激酶(integrin linked kinase，ILK)起重要作用。研究提示，ILK在 TGF-β1/Smad信號傳導途徑介導的EMT過程中扮演重要的角色，在腎間質纖維化的病程中起重要作用［3-5］。

我們在臨床中用化瘀泄濁方治療慢性腎衰竭取得了較好的療效。同時我們在前期的實驗中已經證實，化瘀泄濁方能夠抑制腎小管上皮細胞轉分化，并能夠通過調節TGFβ1/Smad信號通路發揮對腎間質纖維化的拮抗作用［6-7］。因此，本研究進一步探討化瘀泄濁方對腎間質纖維化大鼠ILK的影響，為進一步探討腎間質纖維化發生、發展的機理，探討化瘀泄濁方多途徑、多靶點拮抗腎間質纖維化的治療作用尋找實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用雌性、健康SD大鼠50只，體重180g±10g，清潔級，由河北醫科大學動物實驗中心提供(動物合格證號冀醫動管字第703058號)。

1.1.2 主要試劑 兔抗大鼠ILK多克隆抗體由美國Santa Cruz公司提供。脫氧核糖核苷三磷酸(d NTPs)、核糖核酸酶抑制劑(Rnasin)、AMV逆轉錄酶、無離子水、GoTaq Green Master Mix、Oligo(dT)15由美國 Promega公司提供。Trizol由美國Invitrogen公司提供，溴化乙錠(EB)由美國 Sigma公司提供，瓊脂糖為西班牙進口分裝，DNA Marker由上海捷瑞生物工程有限公司提供。

1.1.3 實驗用藥 化瘀泄濁方:黃芪30g，地龍 12g，生大黃 12g，赤芍 15g，丹參 15g，槐花 15g，蒲公英15g，生牡蠣30g。由河北醫科大學中醫院藥房提供，上藥按比例稱取后水煎、過濾、濃縮，裝入瓶中密封備用。西藥對照藥:纈沙坦(批號X0538)由北京諾華制藥有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 動物模型與分組 動物隨機分為假手術組(簡稱SHAM組)、模型組(簡稱UUO組)、化瘀泄濁方組(簡稱 UUOZ組)、纈沙坦組(簡稱 UUOV組)、阿魏酸哌嗪分散片組(簡稱 UUOA組)，每組10只。除假手術組外其余各組均行左側輸尿管結扎術［8］。手術前 1d開始給藥，化瘀泄濁方組大鼠經口灌服化瘀泄濁方5.7g/(kg·d);阿魏酸哌嗪分散片組大鼠經口灌服阿魏酸哌嗪分散片6.7mg/(kg·d);纈沙坦組大鼠經口灌服纈沙坦5.3mg/(kg·d);假手術組和模型組灌服同等量生理鹽水，給藥至實驗結束前1d。于實驗第21天全部殺檢，取左側腎臟去掉被膜，濾紙吸干血跡，取部分腎皮質保存于－80℃冰箱中用于RT-PCR，部分用4%多聚甲醛固定，留作常規病理學觀察及免疫組織化學觀察。

1.2.2 免疫組織化學方法 SABC法。半定量分析:采用HPIAS-1000型全自動彩色病理圖像分析系統，在200倍光鏡下采集圖像，每例各選15個視野，計算1個視野中陽性細胞百分數，在光亮度和放大倍數一致的條件下對免疫組化結果進行自動測量，最后取平均值。

1.2.3 RT-PCR ILK引物:長度 400 bp。上游引物:5’-GCACTCAATAGCCGTAGTG-3’，下游引物:5’-CCTACTTGTCCTGCATCTTC-3’，反應條件:94℃預變性 5min，94℃ 50s，56℃ 60s，72℃ 1min，共32個循環，最后72℃ 8min充分延伸。GAPDH:長度452bp。上游引物:5’-ACCACAGTCCATGCCAT CAC-3’，下游引物:5’-TCCACCACCCTGTTGCTTA-3’，擴增產物反應條件:94℃預變性3min 94℃ 45s，60℃ 60s 72℃ 1min，共 38個循環，最后 72℃ 7min充分延伸。將 PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，置于凝膠圖像分析系統 (UVP公司，美國 )進行吸光度掃描，以管家基因 GAPDH作為內參照校正，用目的基因的吸光度與 GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相對表達含量。每個樣本的每個指標重復做3次，取其均值。

1.3 統計學處理方法

采用SPSS13.0統計軟件包進行統計分析，采用One-Way ANOVA，組間兩兩顯著性比較采用 LSD法，顯著性標準為P＜0.05。

2 結果

2.1 ILK蛋白的表達、分布及半定量分析結果

ILK主要表達于腎小管上皮細胞胞漿中，假手術組ILK在腎小管上皮細胞中表達很弱。與假手術組比較，模型組和各治療組ILK的表達顯著增強，差異有統計學意義(P＜0.05);與模型組相比，化瘀泄濁方組、阿魏酸哌嗪分散片組、纈沙坦組ILK的表達減弱，差異有統計學意義(P＜0.05)，其中化瘀泄濁方組ILK的表達優于阿魏酸哌嗪分散片組，差異有統計學意義(P＜0.05)，其他各組間均無明顯差異(P＞0.05)(表1)。

2.2 ILK mRNA的表達及半定量分析結果

ILK RT-PCR半定量分析結果顯示，與假手術組比較，模型組和各治療組ILK的表達顯著增強，差異有統計學意義(P＜0.01);與模型組相比，化瘀泄濁方組、阿魏酸哌嗪分散片組、纈沙坦組ILK的表達減弱，差異有統計學意義(P＜0.05)，其中化瘀泄濁方組ILK的表達弱于阿魏酸哌嗪分散片組，差異有統計學意義(P＜0.05)，其他各組間均無明顯差異(P＞0.05)(表 1)。

3 討論

本病屬于中醫的“虛勞”、“腰痛”、“淋證”、“關格”、“癃閉”等范疇，其病因病機有以下幾個方面:①先天異常:慢性腎衰竭的病因與患者素體虛弱、加之過勞、外邪等誘因密切相關。正虛之中尤以氣虛為主，或兼氣陰兩虛，邪實有外邪、水停、濕濁、蘊痰、瘀血等多種。治療慢性腎衰時應首先重視權衡標本緩急，緩則治本，采用相應的益氣、養陰、助陽之法以扶助正氣固本。同時，“久病必瘀”，血不利則為水，瘀血阻滯，水濕郁結于內;或瘀血內阻，氣滯血瘀?？傊?，本病是以濕熱、瘀血、絡阻、氣虛等為基本病機，且相互轉化、相互影響。本實驗針對上述病機提出以化瘀通絡、泄濁解毒為治療大法，兼以益氣，自擬化瘀泄濁方治療本病。方中地龍、赤芍、丹參、大黃化瘀通絡，槐花、公英清熱利濕、解毒泄濁，生牡蠣軟堅散結，黃芪益氣且有走而不守之性，不僅可以扶正固本，還可以助丹參、地龍等化瘀通絡、祛邪治標，諸藥相伍通補并用，標本兼顧。

表1 各組大鼠ILK蛋白和基因的表達(珋x±s)

腎間質纖維化主要表現為細胞外基質(extracellular matrix ECM)的大量積聚和間質肌成纖維細胞(Myofibroblast，MyoF)的增生。MyoF是合成細胞外基質的主要細胞，MyoF數量與RIF的程度成正相關，被認為是預測RIF最好的指標。MyoF除了小部分直接由成纖維細胞活化而來以外，還有相當一部分由腎小管上皮細胞轉化而來。這一過程稱為小管上皮細胞-肌纖維細胞轉分化(renal tubular epithelial to mesenchymal transition，EMT)［10］，EMT在腎間質纖維化的形成過程中起到關鍵性的作用［2］。研究 表 明，ILK參 與 了 EMT的 多 個 過程［2、11］。另有研究表明，TGF-β1 是目前所公認的致腎纖維化重要因子，它能通過多種途徑參與 EMT，在TGF-β誘導的 EMT過程中 ILK起重要作用，可以阻止EMT的發生。同時有研究證實，抑制Smad信號途徑后，能抑制 TGF-β1引起的 ILK表達增多和EMT，所以 ILK可能是 TGF-β1激活的信號通路下游的一個重要因子，在EMT中發揮著重要作用。即ILK因為參與 TGF-β1/Smad信號通路進而參與EMT，是EMT過程中的一個重要調節者，在腎間質纖維化的發生中有重要作用［3、4］。

在前期研究中，我們通過觀察TGFβ1和磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)的表達，證實了化瘀泄濁方能夠通過抑制腎組織 TGFβ1、p-Smad2/3蛋白的表達，從而延緩病變腎組織纖維化進程，發揮對腎間質纖維化的拮抗作用［6、7］。本項研究中，我們繼以化瘀泄濁方對腎間質纖維化大鼠進行干預性治療，觀察了在EMT過程中起關鍵作用的TGF-β下游因子-整合素連接激酶(ILK)。結果顯示，化瘀泄濁方對腎間質纖維化大鼠具有明確的治療和保護作用，能減輕腎臟病理損害，減少纖維化面積。我們通過用免疫組化和RT—PCR檢測ILK蛋白及其mRNA在腎間質纖維化大鼠腎組織中的表達情況，結果發現化瘀泄濁方對于腎間質纖維化大鼠腎組織中ILK的表達具有一定的抑制作用，從而減少腎小管上皮細胞轉分化，使病變腎組織ECM合成減少，發揮對腎間質纖維化的治療作用。

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