降濁化瘀合劑對2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠糖脂代謝和胰島素敏感性的影響*

彭繼升，楊晉翔，高彥彬

胰島素抵抗(IR)在2型糖尿病(T2DM)和非酒精性脂肪肝(NAFLD)的發病機制中占據著重要地位，可以說是IR將二者聯系起來。血糖和血脂的代謝紊亂是糖尿病的重要特征，而NAFLD正是由于脂質代謝紊亂而引起的肝臟脂肪變性，血糖的異常也必然影響到脂代謝的紊亂。本實驗觀察了降濁化瘀合劑對T2DM合并NAFLD大鼠糖脂代謝和胰島素敏感指數(HOMA-IR)的影響。

1 材料與試劑

1.1 動物及飼料

清潔級雄性 SD大鼠40只，體重150g～190g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供;動物飼料由北京科澳協力飼料有限公司提供，改進高脂飼料構成比為2%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙硫氧嘧啶，5%蔗糖，10%豬油，82.3%基礎飼料;普通高脂飼料構成比為2%膽固醇，10%豬油，88%基礎飼料。

1.2 主要試劑

鏈脲佐菌素(STZ)由美國 Sigma公司提供，臨用時以0.1mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液 pH 4.4配成1%STZ溶液;馬來酸羅格列酮(文迪雅)由葛蘭素史克(天津)有限公司生產，規格 4mg/片;降濁化瘀合劑(由柴胡、枳實、茵陳、澤瀉、熟軍、全栝樓、丹參等按一定比例組成)，由北京中醫藥大學東方醫院制劑中心提供，用煎煮法浸提濃縮至稠膏狀，以蒸餾水稀釋成2g生藥/ml的濃度;游離脂肪酸(FFA)酶聯免疫試劑盒由美國GBD公司提供;胰島素放免檢測試劑盒由解放軍總醫院科技開發中心放免研究所提供。

2 方法

2.1 造模方法及分組處理

將40只雄性SD大鼠適應性飼養基礎飼料7d后，按體重隨機分為2組，正常組8只，高脂組32只。正常組喂養基礎飼料，高脂組喂養改進高脂飼料，高脂組大鼠喂養4周后隨機處死2只，取肝臟組織進行HE染色，觀察肝臟組織形態學改變(見圖1、圖2)。3d后各組大鼠禁食12h，高脂組給予一次性腹腔注射 STZ 30mg/kg，正常組給予同等體積的枸櫞酸緩沖液腹腔注射。注射48h后，各組大鼠禁食12h后斷尾取血，測空腹血糖(FPG)、空腹胰島素水平(FINS)。以空腹血糖高于7.8mmol/L作為T2DM診斷的血糖標準，并計算胰島素敏感指數(HOMA-IR)，以判定胰島素抵抗狀態誘導成功。高脂組大鼠肝臟形態學符合NAFLD病理改變(見圖1、圖2)，血糖全部符合 T2DM診斷標準，且 FINS、HONA-IR均明顯高于正常組(見表1)，全部符合造模要求，至此T2DM合并NAFLD大鼠造模過程結束。

將造模成功大鼠按1∶1∶1比例隨機分為模型組、中藥組和西藥組。中藥組給予降濁化瘀合劑10ml/kg/d(生藥20g/kg/d)灌胃，西藥組給予文迪雅2mg/kg/d灌胃，模型組和正常組灌服蒸餾水10ml/kg/d。正常組仍給予基礎飼料喂養，模型組、中藥組、西藥組給予高脂飼料喂養，連續給藥觀察8周。末次給藥后空腹過夜，以0.4%水合氯醛腹腔注射進行麻醉，經腹主動脈取血，收集血清用于指標的測定，取肝備用，HE染色，進行病理學觀察。

2.2 檢測方法

空腹血糖(FPG)、血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)經全自動生化儀(日立7600)檢測;空腹胰島素(FINS)用放免法，FFA采用酶聯免疫法，均嚴格按試劑盒說明書進行。胰島素抵抗指數計算(HOMA-IR)=FINS×FBG/22.5。

2.3 統計學方法

應用SAS 8.0統計軟件包進行，計量資料以珋x±s表示;2組間比較用 t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較用q檢驗。治療前后比較采用配對t檢驗，組間比較采用one-way ANOVA檢驗;計數資料用χ2檢驗，等級資料用Wilcoxon秩和檢驗。

3 結果

3.1 T2DM合并NAFLD大鼠模型的建立

3.1.1 肝臟組織HE染色 喂養4周后，正常組肝小葉結構清晰完整，肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細胞形態正常;肝竇正常，連接成網狀(見圖1)。高脂組肝細胞內出現大量大小不一的脂肪空泡，符合NAFLD病理改變(見圖2)。

圖1 正常組肝組織(HE染色×200)

圖2 高脂組肝組織(HE染色×200)

3.1.2 胰島素抵抗情況 表1顯示，大鼠高脂飼料喂養加小劑量STZ注射后，第5周所測血糖結果全部符合 T2DM診斷標準;其 FBG、FINS明顯高于正常組(P＜0.01)，HOMA-IR也明顯高于正常組大鼠(P＜0.01)。

表1 FBG、FINS和HOMA-IR的比較(珋x±s)

3.2 藥物干預后

3.2.1 對FPG、FINS和HOMA-IR的影響 表2顯示，與正常組大鼠相比較，模型組大鼠 FPG、FINS明顯升高，HOMA-IR也升高(P＜0.01)。與模型組大鼠比較，西藥組FBG與HOMA-IR降低(P＜0.05)，實驗結果與馬來酸羅格列酮改善IR、降糖的作用相一致;中藥組FPG雖無明顯變化，但HOMAIR低于模型組大鼠(P＜0.05)，提示中藥降濁化瘀合劑具有改善IR的作用。

表2 FPG、FINS和HOMA-IR的比較(珋x±s)

3.2.2 對血脂的影響 表3顯示，與正常組大鼠相比較，模型組大鼠血清 TG、TC、LDL-C、FFA水平均明顯升高(P＜0.01)。與模型組大鼠相比較，中藥組、西藥組大鼠的血清TG、TC水平均顯著降低(P＜0.01);2組血清LDL-C與模型組比較無差異(P＞0.05);中藥組血清FFA顯著低于模型組(P＜0.05)，西藥組血清FFA與模型組比較無明顯變化(P＞0.05)。中藥組血清 TG、FFA水平顯著低于西藥組(P＜0.01)。

表3 結果血脂水平的比較(珋x±s)

4 討論

4.1 T2DM合并NAFLD大鼠模型的建立

NAFLD是T2DM的常見并發癥，常與肥胖、高脂血癥等心腦血管病危險因素一起出現，且發病率越來越高。為對T2DM合并NAFLD的發病機制和治療等進行深入研究，建立一個理想的動物模型尤為重要。

目前T2DM的動物模型多采用遺傳因素占主導作用或STZ誘導的方法，有學者提出長期高脂飲食加小劑量STZ建立更為符合人類T2DM特點的動物模型;NAFLD最常用的動物模型是通過高脂和/或高膽固醇飼料喂養制備?？梢钥闯?，高脂飲食是T2DM、NAFLD動物成模的重要因素。鑒于以上認識并參考文獻［1-2］，我們采用改良高脂飼料(在普通高脂飼料中加入少量蔗糖、膽酸鹽和丙基硫氧嘧啶)，結合小劑量STZ處理，建立T2DM合并NAFLD的大鼠模型。

本法在飼料中加入蔗糖，可增加長鏈脂肪酸的合成而使TG的合成增加，且當血糖升高時，促使由乙酰酶A轉變成的膽固醇也增加［3］。飼料中加入少量膽酸鹽和抗甲狀腺藥物丙基硫氧嘧啶，可干擾脂代謝，誘發高脂血癥，促進脂肪肝的形成。然后以STZ劑量30mg/kg一次性腹腔注射，在一定時間內破壞適量的胰島β細胞，引起糖代謝紊亂。本建模方法以肝臟形態學改變、血糖、胰島素敏感指數作為大鼠建模成功的觀測指標，成功建立模型時間僅用5周。

從實驗結果看，本造模方法成模率高、死亡率低、造模周期短，且模型符合人類 T2DM合并NAFLD的發病特點，是研究T2DM并NAFLD比較理想的動物模型。

4.2 降濁化瘀合劑對T2DM合并NAFLD大鼠的影響

T2DM患者常易并發NAFLD。流行病學資料顯示，21%～78%的2型糖尿病患者中存在脂肪肝。目前對于二者的發病機制尚未完全明確，但一致認為IR是二者共同的發病基礎，且糖脂代謝紊亂在發病中發揮著重要作用。在T2DM患者中，高血糖合并脂質代謝紊亂頗為常見，其典型的脂譜表現為血清TC、TG、FFA及 LDL-C增高，其機制主要為 IR和高血糖對脂代謝的影響，促進TC的沉積和高TC血癥的形成［4］。肝臟是脂類物質消化、吸收、代謝等過程中的重要器官，當肝臟中脂質的生成超過肝臟的轉運能力時，便造成肝臟中脂質的累積和脂肪肝的形成。

隨著研究的深入，發現脂質代謝紊亂對細胞存在著毒性作用，即所謂“脂毒性”，其與T2DM及并發癥的發生和發展密切相關［5］。本次實驗采用高脂飼料誘導IR和NAFLD的產生，即可看作是“脂毒性”的作用。注射STZ使T2DM模型建立后，IR及INS分泌不足的狀況又進一步加重了脂代謝紊亂的程度。而血液中過高濃度的FFA所產生的“脂毒性”，又可使β細胞功能進一步下降，IR進一步加劇，加重了T2DM，如此形成惡性循環。因此，T2DM合并NAFLD的治療打破這種惡性循環尤為重要。

降濁化瘀合劑是導師楊晉翔和高彥彬教授治療T2DM合并NAFLD的有效方劑。我們認為，T2DM合并NAFLD的發生，多由先天不足、飲食不節、嗜食肥甘厚味，加之嗜臥少動，日久導致脾失運化、精微不化、釀濕生痰、郁于肝中而成，日久可由實致虛、臟腑失調、變證百出，故倡導早期治療。病變早期以肝脾為中心，肝氣郁滯、痰瘀阻絡為主要證候，治療以疏肝理氣、化痰通絡為法。降濁化瘀合劑中柴胡、枳實疏肝理氣，茵陳、澤瀉、熟大黃、全栝樓化痰降濁，丹參活血通絡，共奏疏肝理氣、化痰通絡之效，臨床應用取得良好療效。

從本實驗中可以看出，模型組大鼠血清 TC、TG、LDL-C和 FFA明顯高于正常組，且 FBG、FINS升高，HOMA-IR顯著升高，證實 T2DN合并非酒精性脂肪肝大鼠血脂代謝紊亂和 IR的存在;模型組HDL-C較正常組升高，可能是高 TC血癥所引起。與模型組比較，中藥治療組TG、TC、FFA明顯改善，且TG、FFA改善程度優于西藥組。中藥組FBG較模型組雖無變化，但HOMA-IR降低，證實降濁化瘀合劑有改善IR的作用。

綜上所述，我們成功建立了T2DM并NAFLD的大鼠模型，降濁化瘀合劑治療T2DM合并NAFLD有改善IR和脂代謝的作用，有利于改變IR與脂代謝紊亂相互影響的惡性循環。

［1］ 王 倩，管小琴.大鼠非酒精性脂肪肝造模方法的改進［J］.世界華人消化雜志，2007，15(11):1219-1224.

［2］ 胡愛民，肖鳳英，鄭 云.2型糖尿病并脂肪肝實驗性大鼠模型的建立及評價［J］.中國中西醫結合消化雜志，2006，14(3):156-159.

［3］ Li z，Soloski MJ，Diehl AM.Dietary factors alter hePatic innate immune system in mice with nonaicoholic fatty liver disease［J］.Hepatology 2005，42:880-885.

［4］ Samuel VT，Liu ZX，Qu X，et al.Mechanism of hepatic insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease［J］.J Biol Chem，2004，279:32345-32353.

［5］ Ginsberg HN，Zhang YL，Hemandez-Ono A.Regulation of plasma triglycerides in insulin resistance and diabetes［J］.Arch Med Res，2005，36:232-240.