左歸丸對(duì)糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松大鼠血清中E 2、P T H含量的影響*

李鴻泓，鞠大宏，滕靜如，李 艷，劉 紅，王少君，潘靜華，于 崢，劉梅潔

左歸丸是滋陰補(bǔ)腎法的代表方劑，出自明代溫補(bǔ)名家張景岳的《景岳全書·新方八陣》，是張景岳由六味地黃丸化裁而來。我們以往的研究表明，其對(duì)卵巢切除所致的大鼠骨質(zhì)疏松癥有一定的治療作用［1-3］。在以往研究工作的基礎(chǔ)上，本研究建立大鼠糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松模型，旨在對(duì)左歸丸對(duì)糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的治療作用機(jī)理進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

Wistar雌性大鼠 42只，體重200g～220g，清潔級(jí)，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào) SCXK(軍)2002-001)。大鼠在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室內(nèi)飼養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室許可證號(hào)SYK11-00-0039)。

1.2 藥物

左歸丸方藥組成:熟地 24g，山藥 12g，枸杞子12g，山萸肉 12g，牛膝 9g，莬絲子 12g，龜板膠 12g，鹿角膠12g。常規(guī)水煎制，含量為9.52g生藥 /kg，給藥濃度為0.952g/ml。地塞米松磷酸鈉注射液:天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)(批號(hào)0704031)，規(guī)格:1ml:5mg，使用時(shí)用生理鹽水稀釋至1mg/ml，給藥體積 0.1ml/100g體重，給藥劑量 0.1mg/100g體重。

1.3 試劑

大鼠血清雌二醇(E2)和甲狀旁腺激素(PTH)ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)ADL公司。戊巴比妥鈉由北京通縣育才精細(xì)化工廠生產(chǎn)(批號(hào)950427);鹽酸四環(huán)素由欣惠澤奧科技有限公司提供(批號(hào)US22105);乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2)由北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司生產(chǎn)(批號(hào)20060324);甲基丙烯酸甲酯由北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn)(批號(hào)20050317);甲基丙烯酸丁酯由北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn)(批號(hào)980716);聚乙二醇400由北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)(批號(hào)050425);苯甲酸甲酯由華北地區(qū)特種化學(xué)試劑開發(fā)中心(天津)生產(chǎn)(批號(hào)980923);過氧化苯甲酰由北京金龍化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)(批號(hào)20000420);N，N－二甲基對(duì)甲苯胺(N，N-Dimethylp-toluidine)由ALDRICH公司生產(chǎn)。Lot.:04327MB-235;Ⅰ液:100ml甲基丙烯酸甲酯 +35ml甲基丙烯酸丁酯+5ml苯甲酸甲酯 +1.2ml聚乙二醇400;Ⅱ液:Ⅰ液+0.4g干燥過氧化苯甲酰;Ⅲ液:Ⅱ液 +0.8g干燥過氧化苯甲酰。

1.4 儀器

冷凍切片機(jī):英國(guó) TBS公司;Reicheit-Jung2040切片機(jī):德國(guó);LEICA CTR6000顯微鏡:德國(guó)Leica公司;Leica-Qwin圖像分析儀系統(tǒng):德國(guó)Leica公司;酶標(biāo)儀:美國(guó) Thermo公司;洗板機(jī):美國(guó)Thermo公司:恒溫恒濕箱:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.5 方法

1.5.1 動(dòng)物分組及處理 將42只雌性 Wistar大鼠隨機(jī)分為3組:空白對(duì)照組12只，模型組15只，左歸丸組15只。模型組大鼠肌注地塞米松0.1ml/100g體重，給藥濃度為 1mg/ml，給藥劑量為1mg/kg體重，每周2次，連續(xù)8周;空白對(duì)照組則相應(yīng)肌注等體積的生理鹽水。左歸丸組除按以上方法肌注地塞米松外，還灌胃給予左歸丸水煎劑1ml/100g體重，給藥濃度為 0.952g生藥/ml，給藥劑量為9.52g生藥/kg體重，以上給藥每天 1次，每周6d，連續(xù)8周。

各組大鼠于處死前16d和前3d分別腹腔注射鹽酸四環(huán)素30mg/kg體重，以對(duì)骨進(jìn)行熒光標(biāo)記。給藥結(jié)束后，采用大鼠麻醉后股動(dòng)脈取血法，所取全血靜置1h后，經(jīng)2000rmp離心10min后取血清，－20℃冰箱保存用于ELISA檢測(cè)。然后將各組大鼠迅速處死，取右側(cè)脛骨制作不脫鈣骨切片，用于骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.5.2 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的測(cè)定 不脫鈣骨切片的制作及染色:取大鼠右側(cè)脛骨近端1/3，4%多聚甲醛溶液固定后用乙醇逐級(jí)脫水:80%、95%、100% 乙醇各2d，二甲苯透明2d。標(biāo)本依次在塑料聚合液Ⅰ液、Ⅱ液、Ⅲ液中各浸泡3d。隨后，將 400μlN，N-二甲基對(duì)甲苯胺 (N，N-Dimethyl-ptoluidine)加入到100ml預(yù)冷(4℃)Ⅲ液中，在青霉素小瓶中注入約7ml的Ⅲ液，將骨標(biāo)本按同一方向放入瓶底用塞蓋緊，用注射器抽空包埋瓶中空氣，然后置于－20℃冰箱中聚合1周左右，變?yōu)闊o色透明的堅(jiān)硬包埋塊。修塊后，每塊個(gè)塊切出5μm的縱向不脫鈣骨切片各2張，其中1張甲苯胺藍(lán)染色，另1張用于熒光觀察。

骨組織形態(tài)計(jì)量方法:采用Leica-Qwin圖像分析儀系統(tǒng)，對(duì)不脫鈣骨切片進(jìn)行形態(tài)計(jì)量。骨小梁體積百分比(TBV%):骨小梁體積占被測(cè)骨髓腔總體積的百分比，是衡量骨量水平的主要標(biāo)志;骨小梁吸收表面百分比(TRS%):不規(guī)則﹑凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，它可判斷破骨細(xì)胞的活性;骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨細(xì)胞被覆的類骨質(zhì)表面占骨小梁表面的百分比，它可判斷成骨細(xì)胞的活性。

1.5.3 外周血血清中雌二醇(E2)和甲狀旁腺激素(PTH)含量的檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清E2和PTH的含量。具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆以珋x±s表示，采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間兩兩比較，采用 q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 左歸丸對(duì)糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的影響

表1顯示，模型組大鼠脛骨TBV%顯著低于空白對(duì)照組，而左歸丸組的TBV%則顯著高于模型組，但與空白對(duì)照組相比仍有顯著差異。與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠脛骨 TRS%顯著增高，而TFS%顯著降低。左歸丸組的TRS%與空白對(duì)照組相比顯著增高，而TFS%明顯降低;與模型組相比，左歸丸組的 TRS%沒有差異，但有明顯降低趨勢(shì)，TFS%則顯著增高。

表1 各組大鼠脛骨TBV%、TRS%及TFS%的變化

2.2 左歸丸對(duì)糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松大鼠血清中E2含量的影響

表2顯示，模型組大鼠血清中E2的含量比空白對(duì)照組顯著降低。左歸丸組大鼠血清中E2的含量與模型組相比，顯著增高，但較之空白對(duì)照組仍顯著降低。

表2 各組大鼠血清中E2的含量

2.3 左歸丸對(duì)糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松大鼠血清中PTH含量的影響

表3顯示，模型組大鼠血清中PTH的含量比空白對(duì)照組顯著增高。左歸丸組大鼠血清中PTH的含量與模型組相比顯著降低，但較之空白對(duì)照組仍明顯增高。

表3 各組大鼠血清中PTH的含量

3 討論

雌激素主要通過對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞直接作用，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分泌的局部細(xì)胞因子，加強(qiáng)降鈣素的分泌，促進(jìn)維生素D的合成，降低PTH對(duì)骨敏感性以及調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)等環(huán)節(jié)對(duì)骨代謝產(chǎn)生影響。總之，雌激素可通過多靶點(diǎn)多環(huán)節(jié)對(duì)骨代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收［4］。而PTH對(duì)骨的主要作用是促進(jìn)骨吸收，這主要是對(duì)破骨細(xì)胞的綜合作用。其對(duì)破骨細(xì)胞的作用是間接增加破骨細(xì)胞中鈣離子的數(shù)量，使破骨細(xì)胞數(shù)量增加，活性增強(qiáng)。同時(shí)，PTH持續(xù)分泌可以激活大量位于骨內(nèi)膜中的骨原始細(xì)胞，使這些細(xì)胞加速分解并形成前破骨細(xì)胞和新破骨細(xì)胞，最終使破骨細(xì)胞的數(shù)量增多、活性增強(qiáng)，促進(jìn)骨的吸收和溶解，使骨鈣釋放入血，提高血鈣水平。

沈培芝等研究補(bǔ)腎方預(yù)防和治療地塞米松致雄性大鼠骨質(zhì)疏松的療效。研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)防組和治療組大鼠的全身骨密度、股骨抗彎強(qiáng)度、血清睪酮水平均明顯高于地塞米松組，而血清甲狀旁腺素水平低于地塞米松組。說明應(yīng)用補(bǔ)腎方可以提高性激素水平并降低血清甲狀旁腺素水平，從而能夠有效地預(yù)防治療地塞米松誘導(dǎo)的雄性大鼠骨質(zhì)疏松［5］。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)連續(xù)大量使用糖皮質(zhì)激素后，作為骨量主要標(biāo)志的脛骨TBV%顯著降低，代表骨吸收參數(shù)的 TRS%顯著增高，而代表骨形成參數(shù)的TFS%降低，表明使用糖皮質(zhì)激素所造成的是一種骨形成降低、骨吸收增加而骨吸收大于骨形成的骨質(zhì)疏松模型。給大鼠灌服左歸丸后，TBV%顯著增高，TRS%與模型組相比雖無差異，但有明顯的降低趨勢(shì)，且TFS%明顯增高。這一結(jié)果表明，左歸丸能使糖皮質(zhì)激素所致骨吸收增高和骨形成降低的骨量丟失狀態(tài)得到控制和逆轉(zhuǎn)，從而導(dǎo)致骨量的增加。實(shí)驗(yàn)還采用ELISA法檢測(cè)了各組大鼠血清中E2和PTH的含量。結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中 E2的含量比空白對(duì)照組顯著降低，而PTH的含量比空白對(duì)照組顯著增高。左歸丸組大鼠血清中E2的含量與模型組相比顯著增高，而PTH含量顯著降低。說明左歸丸可以調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素所致的E2和PTH的紊亂狀態(tài)，使之恢復(fù)到基本正常，這是其治療糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)理之一。

總之，左歸丸可通過調(diào)節(jié)血清中 PTH和E2的水平而達(dá)到治療糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的目的，使PTH的水平下調(diào)，同時(shí)上調(diào)E2的水平，使其紊亂狀態(tài)基本恢復(fù)正常。當(dāng)然，左歸丸治療糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的機(jī)理是非常復(fù)雜的，本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)其中幾個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了探討，其機(jī)理還有待于進(jìn)一步的深入研究。

［1］ 劉梅潔，鞠大宏，趙宏艷，等.“腎主骨”的機(jī)理研究—左歸丸含藥血清對(duì)破骨細(xì)胞分化調(diào)控因子OPG、RANKL蛋白表達(dá)的影響.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15(3):184-187，196.

［2］ 鞠大宏，劉梅潔，趙宏艷，等.左歸丸含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞OPG、RANKL mRNA表達(dá)的影響.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào).

［3］ 鞠大宏，趙宏艷，劉梅潔，等.左歸丸含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞 IL-1、IL-6和COX-2表達(dá)的影響.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2006，14(2):96-99.

［4］ 李 恩，等編著.骨質(zhì)疏松鑒別診斷與治療.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005.

［5］ 沈培芝，陳東煜，張 戈，等.補(bǔ)腎方防治地塞米松致雄性大鼠骨質(zhì)疏松及其生化機(jī)制探討.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1998，18(5):290-292.