兒茶素對小鼠巨噬細胞VCAM-1表達的影響

趙興梅，范春雷

(浙江中醫藥大學生命科學學院，杭州浙江 310053)

血管細胞黏附因子介導的血管炎性病變是很多疾病［如動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)［1］、風濕病、腎病等］共同的病理基礎。研究發現［2］AS的血管壁中有VCAM-1的大量表達。過量表達的VCAM-1介導的炎癥反應參與了AS發生發展的全過程［3］。兒茶素(catechin)是從茶葉中提取的酚類物質，有良好的調血脂抗AS作用。本實驗以小鼠巨噬細胞RAW26.7為材料，考察兒茶素對oxLDL誘導［4］的巨噬細胞VCAM-1表達的影響，探討兒茶素抗AS的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器小鼠巨噬細胞株RAW264.7，本實驗室液氮儲存。兒茶素標準品購自安徽甙爾塔天然有機化合物信息中心。oxLDL，本實驗室制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 兒茶素對RAW264.7細胞增殖活性的測定 根據預實驗，設兒茶素作用濃度分別為5、15、20、30 μmol·L－1;MTT 法檢測不同濃度兒茶素對RAW264.7增殖的影響。

1.2.2 兒茶素對oxLDL誘導的巨噬細胞VCAM-1表達的影響設5個組:正常對照組，模型對照組和3個給藥組。正常對照組:只加入5 ml完全培養液;模型對照組:加入5 ml完全培養液+終濃度為12 mg·L－1的ox-LDL;加藥組:加入5 ml完全培養液+終濃度為12 mg·L－1的ox-LDL和終濃度分別為5、15、25 μmol·L－1的兒茶素。各組置體積分數為0.05的CO2，37℃培養箱培養24 h。分批提取細胞總RNA和細胞總蛋白后，通過實時熒光定量PCR法，Western blot法和ELISA法檢測各組VCAM-1的表達量，具體方法如下:

實時熒光定量PCR逆轉錄為CDNA按照M－MLV(RNase H)逆轉錄試劑盒說明進行。引物:Sense:5'-GTTTGGCTCCAGACATTTACCC-3'，Anti-sense:5'-TGTAGTTCTTTGACAGTCTCCCTTTCTTT-3'，產物大小:246 bp。

用小鼠β-actin作內參基因(ref)。各組的目的基因和內參基因均做3個重復。按Bio Easy SYBR Green試劑盒說明進行。

1.3 數據分析各組實時定量PCR結果的Ct值計量資料數據用± s表示，以 2－△△Ct法進行基因表達量的半定量分析。Western blot檢測VCAM-1蛋白的表達，利用凝膠成像系統對蛋白條帶圖像進行采集。ELISA檢測VCAM-1的表達，按照Soluble mouse VCAM-1 ELISA Kit說明書進行。

2 結果

2.1 兒茶素對RAW264.7細胞增殖活性的測定MTT結果表明，與陰性對照組相比，兒茶素在 0 ～25 μmol·L－1內對RAW264.7的細胞增殖無影響，可以在這個濃度范圍內研究兒茶素對RAW264.7細胞VCAM-1表達的影響。

2.2 兒茶素對oxLDL誘導的巨噬細胞VCAM-1基因表達的影響實時熒光定量PCR結果表明(Tab 1):model組與control組相比:VCAM-1基因表達量是它的581.59%，說明造模成功。5、15、25 μmol·L－1的 catechin 組與 model組相比:VCAM-1 基因表達量分別是它的18.56%、17.19%、11.99%。故5～25 μmol·L－1的兒茶素能抑制oxLDL對巨噬細胞VCAM-1基因表達的誘導作用，并且在5～25 μmol·L－1的濃度范圍內存在量效關系。

2.3 兒茶素對oxLDL誘導的巨噬細胞VCAM-1蛋白表達的影響Western blot和ELISA(Tab 2)結果表明兒茶素能抑制ox-LDL對RAW264.7細胞VCAM-1基因表達的誘導作用。ELISA實驗顯示:模型對照組與正常對照組相比，P＜0.01。各給藥組與模型對照組相比，P＜0.01。

3 討論

多種炎性細胞因子的過度釋放是AS形成的重要步驟［5］。VCAM-1主要存在于內皮細胞膜上，同時也表達于平滑肌細胞、巨噬細胞等［6］，受致炎因子刺激增加。它特異地與白細胞(除中性粒細胞外)所產生的Integrin家族的黏附因子VLA-4結合［7］，主要介導淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和內皮細胞的黏附和信號傳遞。

Tab 1 Effect of catechin on VCAM-1 mRNA expression induced by ox-LDL in macrophages(± s，n=3)

Tab 1 Effect of catechin on VCAM-1 mRNA expression induced by ox-LDL in macrophages(± s，n=3)

△△P＜0.01 vs control;＊＊P＜0.01 vs model

Group Ct(target) Ct(ref) △Ct △△Ct 2－△△Ct /%Control 13.19 ±0.16 12.39 ±0.18 0.80 ±0.25 0 100 Model 12.41 ±0.56 14.48 ±0.63 －2.06 ±1.02 －2.54△△ 581.59△△Catechin 5 μmol·L －1 13.13 ±0.12 12.76 ±0.40 0.37 ±0.29 2.43＊＊ 18.56＊＊Catechin 15 μmol·L －1 12.96 ±0.37 12.48 ±0.33 0.48 ±0.08 2.54＊＊ 17.19＊＊Catechin 25 μmol·L －1 13.32 ±0.28 12.26 ±0.11 1.06 ±0.28 3.06＊＊ 11.99＊＊

Tab 2 Effect of catechin on VCAM-1 expression induced by ox-LDL in macrophages detected by ELISA( ± s)

Tab 2 Effect of catechin on VCAM-1 expression induced by ox-LDL in macrophages detected by ELISA( ± s)

△△P ＜0.01 vs control，＊＊P ＜0.01 vs model

Group OD value( ± s)VCAM-1(pg)in 100 ng TP Control 0.126 ±0.003 0.080 ±0.003 Model 0.129 ±0.001 0.125 ±0.005△△Catechin 5 μmol·L －1 0.108 ±0.001 0.066 ±0.006＊＊Catechin 15 μmol·L －1 0.071 ±0.002 0.025 ±0.002＊＊Catechin 25 μmol·L －1 0.059 ±0.003 0.011 ±0.001＊＊

本實驗檢測了兒茶素對小鼠巨噬細胞VCAM-1表達的影響，結果顯示5～25 μmol·L－1的兒茶素均能抑制oxLDL對巨噬細胞VCAM-1表達的誘導作用，并且在5～25 μmol·L－1的濃度范圍內存在量效關系。兒茶素能降低oxLDL誘導的巨噬細胞VCAM-1的表達，這可能是其發揮抗AS藥效的又一機制。

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