芝麻素對代謝綜合癥大鼠心肌NT、NF-κB和MMP-9蛋白表達的影響

孔 祥，楊解人，張明義，吳向起

(皖南醫學院藥理學教研室，國家中醫藥管理局中藥藥理三級實驗室，安徽蕪湖 241002)

代謝綜合癥(metabolic syndrome，MS)是以胰島素抵抗為病理生理基礎，伴有中心性肥胖、高血脂、高血壓、糖尿病或空腹血糖增高的癥候群［1］。MS中的每個致病因素均能對心臟造成嚴重危害。隨著MS發病率呈明顯上升趨勢，心血管并發癥亦急劇增加。芝麻具有“補肝腎、潤五臟、增氣力、消炎止痛、生發”等功效，長久以來一直被視為滋補圣品。芝麻素(sesamin，Ses)是從芝麻中提取出的活性成份，藥用價值日益受到重視。日本學者報道［2－3］Ses對于高血脂和高血壓患者有一定的降脂和降壓作用。我們之前研究報道［4－5］Ses通過抗氧化應激改善飲食誘導的MS大鼠心肌和腎臟損傷，通過降低c-fos蛋白表達逆轉腎性高血壓伴高血脂大鼠心肌肥厚［6］，但Ses對兩腎一夾術伴高脂高糖飲食誘導的MS大鼠心肌重構的影響尚未見文獻報道。

硝基酪氨酸(NT)是內源性過氧亞硝酸鹽陰離子(ONOO－)的特異性標記物。核因子-κB(NF-κB)作為重要的轉錄因子在心肌炎癥反應、細胞壞死、凋亡等病理生理過程發揮重要作用。基質金屬蛋白酶(MMPs)是特異性降解細胞外基質的鋅依賴性蛋白酶家族，在心肌重構中起重要作用。因此，本實驗采用兩腎一夾術伴高糖高脂飲食誘導大鼠MS模型，觀察Ses對大鼠心肌組織中NT、NF-κB和MMP-9蛋白表達的影響，以探討其防治MS大鼠心肌重構的作用及可能機制。

1 材料

1.1 動物和飼料♂SD大鼠52只，體質量200～240 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號:SCXK(京)2007-0001。解放軍總醫院實驗動物中心嚙齒類動物實驗室分籠飼養，自由進食和飲水。飼料配方見作者之前報道［7］，由軍事醫學科學院實驗動物中心制作，許可證號:SCXK(軍)2002-018。高糖高脂飼料含有18%蛋白質，22%脂肪(含15%熟豬油和2%膽固醇)，46%碳水化合物(含25%蔗糖)。飼料的熱量組成和密度如下，高糖高脂飼料:蛋白16%，脂肪44%，碳水化合物40%和4.5 Kcal·g－1;普通飼料:蛋白 28%，脂肪13%，碳水化合物 59%和 3.1 Kcal·g－1。

1.2 主要試劑和藥物Ses(純度＞94%)，由蕪湖天一綠寶科技有限公司提供(批號04312)［7］;甘油三酯(triglyceride，TG)和總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒購自深圳邁瑞生物醫療公司;胰島素(insulin，Ins)放免試劑盒購自北京普爾偉業生物科技公司;總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;NT和NF-κB p65抗體購自Santa Cruz公司;MMP-9和β-actin抗體購自武漢博士德公司;辣根過氧化物酶標記二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司;ECL試劑盒購于Pierce公司。

Tab 1 Effects of Ses on BW，SBP and lipid metabolism in MS rats( ± s)

Tab 1 Effects of Ses on BW，SBP and lipid metabolism in MS rats( ± s)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs model

Group Dose/mg·kg－1 n BW/g SBP/kPa TG/mmol·L －1 TC/mmol·L －1±0.48 Model － 10 630.5 ±27.1* 23.6 ±0.91* 2.06 ±0.49* 3.47 ±1.27*Ses 120 8 563.3 ±40.5# 18.6 ±1.21# 1.41 ±0.36*# 2.36 ±0.52*#60 8 587.9 ±35.0* 20.2 ±1.21*# 1.65 ±0.22*# 2.82 ±0.45*30 8 611.3 ±43.8* 21.6 ±0.87* 1.83 ±0.32* 3.20 ±0.62 Sham － 10 523.2 ±31.3 15.4 ±0.79 0.90 ±0.33 1.17*

2 方法

2.1 模型制備、分組及處理Goldblatt法復制大鼠腎性高血壓模型，適應1周后除假手術組外，其余大鼠給予高糖高脂飼料12周。NIBP無創尾動脈血壓測定分析系統檢測大鼠收縮壓(systolic blood pressure，SBP)［7，8］，術后 5 周達 21.3 kPa 以上的 44 只大鼠隨機分為 MS模型組(model，n=10)，Ses高、中、低劑量治療組(120、60、30 mg·kg－1，n=8)，另設假手術組(sham，n=10)。Ses用0.5%羧甲基纖維素制成混懸液，假手術和模型組給予等容積羧甲基纖維素。于每日上午9時灌胃給藥，1 h后自由進食，連續給藥8周。于實驗結束后(13周末)，大鼠禁食 12 h，稱體重(body weight，BW)，麻醉后腹主動脈取血，分離血清。迅速開胸，取心臟，稱全心濕重(heart wet weight，HWW)和左心室濕重(left ventricle wet weight，LVWW)。取部分心肌用10%甲醛固定，用于HE和Masson染色，部分凍存于－80℃冰箱備用。

2.2 血液指標檢測酶法測定血清TC、TG含量，血糖儀測定大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，放免法測血清Ins水平，比色法測血清T–AOC，具體步驟見試劑盒說明書，并嚴格按說明書正規操作。采用李氏法［9］計算胰島素敏感指數(insulin sensitive index，ISI):ISI=Ln(1/FBG ×FIns)。

2.3 Western blot檢測心肌 NT、NF-κB 和 MMP-9蛋白表達參照 Schreiber等［10］和作者之前的報道［7］，分別提取心肌組織核蛋白和總蛋白，取上清用Lowry法進行蛋白定量。以40 μg蛋白/泳道上樣，經SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉膜至PVDF膜，室溫封閉2 h。洗膜后分別加入一抗(NT 1∶800;NF-κB p65 1 ∶1 000;MMP-9 和 β-actin 1 ∶500稀釋)4℃孵育過夜。洗膜后二抗(1∶2 500稀釋)室溫孵育2 h。ECL化學發光法顯色，拍攝照片。根據積分吸光度(integrated absorbance，IA)值對比分析條帶強弱，以β-actin為內參照進行半定量分析。

2.4 心肌組織病理學檢查石蠟橫斷面連續切片5～6片，厚度約5 μm，切片常規脫蠟脫水，HE染色觀察心肌病理改變。Masson染色后，運用Image-Pro Plus 6.0 Software圖像分析系統，將圖像放大400倍，隨機選取10個視野，通過測量選定區域染色組織的面積(藍色代表膠原纖維)，計算每個視野中膠原面積與心肌組織總面積的比值，取其均值即為每只大鼠膠原容積分數(collagen volume fraction，CVF)。含膠原豐富的冠脈細小血管區域不納入測量范圍內。

2.5 統計學分析數據結果以±s表示，采用SPSS 13.0軟件分析，多組間比較采用單因素方差分析和q檢驗。

3 結果

3.1 對BW、SBP和血脂的影響MS模型組BW、SBP、TG和TC較假手術組增高(P＜0.05)。與模型組相比，Ses 120、60 mg·kg－1組 SBP 和 TG 明顯降低;120 mg·kg－1組 BW 和 TC明顯降低(P＜0.05)，表明Ses具有降低血壓和血脂的作用，與作者之前報道一致(Tab 1)。

3.2 對FBG、Ins水平和 ISI的影響MS模型組FBG和血清Ins水平增高，ISI明顯降低(P＜0.05)。與模型組相比，Ses 120、60 mg·kg－1組 FBG、Ins水平降低，ISI明顯上升(P＜0.05)，說明Ses具有降低血糖和改善胰島素敏感性的作用(Tab 2)。

Tab 2 Effects of Ses on FBG，INS level and ISI in MS rats(±s)

Tab 2 Effects of Ses on FBG，INS level and ISI in MS rats(±s)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs model

Group Dose/mg·kg－1n FBG/mmol·L －1 Ins/mIU·L－1ISI Sham － 10 4.22 ±0.26 15.2 ±6.6 －4.07 ±0.51 Model － 10 5.46 ±0.41* 62.6 ±18.4* －5.79 ±0.39*Ses 120 8 4.58 ±0.34# 32.8 ±9.9*# －4.97 ±0.40*#60 8 4.85 ±0.31*#41.8 ±11.6*#－5.28 ±0.34*#30 8 5.14 ±0.39* 52.4 ±14.3* －5.56 ±0.37*

3.3 對HWW、LVWW和T-AOC的影響MS模型組HWW和LVWW增高，血清T-AOC明顯降低(P ＜0.05)。與模型組相比，Ses 120、60 mg·kg－1組HWW 降低，T-AOC明顯上升;120 mg·kg－1組LVWW降低(P＜0.05)，表明Ses具有改善心肌肥厚和抗氧化應激的作用(Tab 3)。

Tab 3 Effects of Ses on HWW，LVWW and T-AOC in MS rats(±s)

Tab 3 Effects of Ses on HWW，LVWW and T-AOC in MS rats(±s)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs model

Group Dose/mg·kg－1n HWW/g LVWW/g T-AOC/kU·L －1 Sham － 10 1.23 ±0.11 0.85 ±0.06 28.4 ±14.9 Model － 10 1.86 ±0.21* 1.54 ±0.20* 7.49 ±4.8*Ses 120 8 1.37 ±0.11# 1.03 ±0.12# 22.5 ±8.2#60 8 1.48 ±0.19*#1.25 ±0.19* 14.7 ±6.4*#30 8 1.69 ±0.13* 1.44 ±0.15* 10.2 ±3.7*

3.4 對心肌病理變化和CVF的影響HE染色可見，MS模型組心肌細胞排列紊亂，肌纖維增粗肥大，組織中可見炎性細胞浸潤。Ses 120 mg·kg－1組病理變化較模型組明顯改善(Fig 1A～C)。光鏡下Masson染色顯示膠原纖維呈藍色，心肌細胞呈紅色。鏡下觀察和半定量分析表明MS模型組心肌間質膠原纖維明顯增多，排列紊亂，分布不均，CVF明顯增高(P＜0.05)。Ses 120 mg·kg－1組膠原積聚明顯減輕，排列趨于規則，CVF降低(P＜0.05，Fig 1D ～G)。

Fig 1 Effects of Ses on pathological changes of myocardium and CVF in MS rats

Fig 2 Effects of Ses on myocardial protein expression of NT，NF-κB and MMP-9 in MS rats

3.5 對心肌NT、NF-κB和MMP-9蛋白表達的影響由 Fig 2可見，MS模型組心肌 NT、NF-κB和MMP-9蛋白表達較假手術組分別增加2.03、1.81和2.40 倍(P ＜0.05)。Ses120、60 mg·kg－1組 NT表達較模型組降低44%和21%，NF-κB表達降低37%和26%，MMP-9表達降低50%和41%(P＜0.05)。

4 討論

本實驗結果顯示，兩腎一夾術和高糖高脂飲食13周誘導的MS大鼠存在高血壓、高血脂和高血糖的“三高”癥狀，同時伴有胰島素抵抗，說明模型制備成功。進一步觀察發現大鼠全心濕重、左室濕重明顯增加，心肌纖維增粗肥大，排列紊亂，心肌間質膠原纖維增多，提示MS大鼠模型在具備代謝紊亂的基礎上，伴有嚴重心肌損傷和重構癥狀。我們前期研究發現長期高糖高脂飲食可誘導以代謝紊亂為主要特點的MS大鼠模型，予以Ses治療可改善其輕度的心肌損傷［4］。本研究發現，兩腎一夾術伴高脂高糖飲食制備的MS模型予以Ses治療8周后，大鼠體重、全心濕重和左室濕重明顯降低，心肌膠原纖維明顯減少，證明Ses具有改善MS大鼠心肌肥厚和抗纖維化的作用。

T-AOC是反映機體整體抗氧化水平的重要指標之一。ONOO－是由活性氧中的超氧陰離子與NO迅速反應生成的產物，是活性和毒性很強的氧化劑，可代表氧化應激水平的升高。ONOO－性質活潑，不易檢測，但其在體內可與酪氨酸殘基結合生成穩定的終末代謝物NT。本實驗發現MS大鼠血清TAOC明顯降低，心肌ONOO－特異性標記物NT蛋白表達明顯增高，提示氧化應激在MS發生發展中發揮重要作用。Ses治療8周后T-AOC升高，NT表達減少，說明改善氧化應激狀態是Ses防治MS心肌損傷的機制之一，與我們之前結論一致［4］。

NF-κB是一種廣泛存在的核轉錄因子，在靜息狀態下主要由p50/p65異源二聚體與抑制物IκB結合形成無活性的三聚體。機體受到外界刺激后，IκB解離、降解，p50/p65移位進入細胞核。p65與靶基因啟動子區域的κB位點結合，調節基因表達，參與炎癥、應激反應和細胞凋亡。因此，p65亞基被認為是NF-κB表達最廣泛，活性最強的亞單位。文獻報道NF-κB調控和轉錄的多種細胞因子在心臟炎癥反應和器官損傷中發揮重要作用［11］。MMPs包括膠原酶、明膠酶和基質溶解素等，是一類分解細胞外基質的鋅依賴性蛋白酶家族，在心肌組織重構中起重要作用。明膠酶(MMP-9)的特性近年來備受關注，認為其通過刺激纖維性膠原合成參與纖維化的發生［12］。本實驗亦發現MS大鼠左室肥大和膠原沉積，同時心肌NF-κB p65和 MMP-9蛋白表達增加。Ses治療后可降低蛋白表達，提示Ses防治心肌重構機制與下調NF-κB和MMP-9表達有關。

研究證明活性氧能直接或間接激活各種下游信號通路，對心肌產生嚴重損傷，在心臟疾病發生和發展中起信號分子作用。文獻報道活性氧能使IκB解離，使得NF-κB p65進入核中與DNA結合，啟動或加強基因轉錄［13］，增加心衰模型心肌MMPs表達和活性［14］。本研究中Ses降低MS大鼠心肌NF-κB和MMP-9蛋白表達作用是其自身的藥理學特性，還是依賴于Ses抗氧化作用的繼發結果尚需進一步探討。近年來，Wu等［15］發現Ses能降低腫瘤壞死因子(TNF)處理的人主動脈內皮細胞NF-κB活性和蛋白表達。Harikumar等［16］報道Ses能降低TNF處理的人慢性白血病KBM-5細胞MMP-9蛋白表達，多種炎癥、致癌因素處理的KBM-5細胞NF-κB活性。因此，結合上述報道，我們認為Ses改善MS心肌重構的機制除抗氧化應激外，還與下調NF-κB和MMP-9蛋白表達有關，但確切機制有待于進一步探討。

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