加味佛手散抑制大鼠子宮內膜異位癥血管生成及其機制

王小翠，楊 洋，陳 剛，鄧禮娟，徐曉玉

(1.西南大學藥學院，重慶市藥效評價工程技術研究中心，重慶 400716;2.重慶工商大學藥物化學與化學生物學研究中心，重慶 400067)

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMS)是育齡婦女最常見的疾病，在一般人群中的發病率為10%～15%［1］。目前主要的治療方式是采用手術移除異位病灶和雌激素治療，但通常會有副作用大且易復發的缺點。近年來研究發現［1］，血管生成在EMS疾病中發揮著重要的作用，因此抗血管生成治療已成為治療EMS的新的途徑。加味佛手散為本實驗室創制的抗EMS的中藥新藥，由中醫婦科著名方劑佛手散主要成份川芎嗪、阿魏酸加延胡索乙素組成，其處方與制備工藝已經申報國家技術發明專利。本文報道了主要藥效學研究中，加味佛手散對EMS血管生成及其相關機制的一部分內容。目前對于川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素3個中藥單體以及配伍合用對大鼠EMS模型的作用，國內外尚未見報道。因此，本研究通過建立大鼠EMS模型，從抑制血管生成角度來研究中藥新藥加味佛手散治療EMS的機制，探討加味佛手散對血管生成促進因子血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)以及血管生成抑制因子內皮抑素(endostatin)蛋白表達的影響，為臨床應用加味佛手散治療EMS提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠70只，♀，體質量180～220 g，清潔級，重慶醫科大學實驗動物中心供應［實驗動物生產許可證號:SCXK(渝)2007－0001］，于西南大學藥學院SPF級實驗動物中心飼養［實驗動物使用許可證號:SYXK(渝)2009－0002］。

1.2 藥品和試劑加味佛手散由西南大學中藥研究所研制提供，主要成分為川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素(原料藥購自南京澤朗醫藥科技有限公司，批號分別為 QZ-0802010、QZ-0801010、QZ-071224)，孕三烯酮膠囊(北京紫竹藥業有限公司，批號53080103)。兔抗大鼠 VEGF抗體、兔抗大鼠 endostatin抗體、小鼠抗大鼠β-actin抗體、兔抗大鼠Ⅷ因子抗體(Santa Cruz公司);免疫組化SP試劑盒、DAB試劑盒、辣根酶標記山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司);PVDF膜、ECL試劑盒(Millipore公司);前列腺素 E2(PGE2)放射免疫分析試劑盒(北京華英生物技術研究所，批號HY－043);其余試劑為進口分裝或市售分析純。

1.3 方法

1.3.1 大鼠子宮內膜異位癥模型的制備［2－3］以大鼠陰道脫落細胞涂片檢測大鼠性激素周期，在大鼠動情期以水合氯醛麻醉，常規消毒，開腹，結扎右側子宮兩端后，從遠端剪取長約1.5 cm的子宮段，剔除脂肪組織，剪成5 mm×5 mm的子宮組織3塊，一塊送病理檢驗，另外兩塊縫于腹壁，以黏膜面朝向腹膜，漿膜面朝向腹腔，關腹。術后腹腔注射慶大霉素，正常清潔飼養。建模4周后，擇動情期第2次開腹觀察移植物生長情況，并用游標卡尺測量移植物大小，以同時符合以下3條標準者為成功模型:①移植物體積增大，被結締組織或大網膜覆蓋并有血管形成，呈隆起透亮的小囊狀，出現液體積聚，且積液高度=2 mm;② 游標卡尺測量移植物的體積大小，異位組織體積=0.52×長×寬×高［4］，移植物體積=8 mm3;③切取移植物送檢，證實移植物中有子宮內膜上皮細胞、腺體及間質的生長。

1.3.2 動物分組 成功建模大鼠隨機分為模型對照組、孕三烯酮0.5 mg·kg－1·d－1以及加味佛手散0.045、0.09、0.18 g·kg－1·d－1。各組灌胃給藥，每天1次，連續4周，正常對照組和模型對照組同時灌胃給予相同容積的0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液。給藥4周后，再次檢查大鼠的性周期，擇動情期手術，分離出腹腔側移植物，通過游標卡尺測量移植物大小，液氮凍存。

1.3.3 免疫組化染色 取異位內膜組織常規包埋，用冰凍切片機5 μm連續切片，4%多聚甲醛固定，抗Ⅷ因子抗體、抗VEGF抗體或抗endostatin抗體為Ⅰ抗，陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)代替Ⅰ抗，按照SP試劑盒說明書進行免疫組化染色，用BI2000數字圖像分析系統軟件進行分析。異位組織MVD，VEGF和endostatin表達計算方法:先在低倍鏡下(×100)進行全面觀察，選取背景對比良好，染色均勻的視野，然后在高倍鏡(×400)下進行觀察，記錄8個視野的陽性細胞表達個數。

1.3.4 Western blot檢測 正常組取原位內膜，模型組、加味佛手散各劑量組和孕三烯酮組各取異位內膜組織約30 mg，在液氮中搗碎成粉末，加入0.5 ml冰預冷的RIPA裂解液和5 mg·L－1Aprotinin和5 mg·L－1Leupeptin的蛋白酶抑制劑，反復勻漿至組織溶解，加入PMSF至終濃度100 mg·L－1，冰上裂解 30 min，1.2 × 104r·min－1離心 30 min，取上清。Bradford法檢測蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液于沸水浴中加熱5 min，取等量蛋白進行 SDSPAGE電泳，轉移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后，加入VEGF，endostatin和內參β-actin抗體4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，再加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃與膜孵育1 h，TBST洗膜后，加入ECL試劑，顯影，定影，分析條帶光密度值，以目的條帶與β-actin條帶的光密度值的比值作為衡量參數，分析VEGF和endostatin蛋白的表達量。

1.3.5 化學發光免疫分析法(CLIA)和放射免疫法(RIA)檢測 給藥4周后，麻醉大鼠后股動脈取血，4℃過夜凝固，3.5 × 103r·min－1離心 15 min，取血清。處死動物后，立即取出各組正常或異位內膜組織，各取25 mg內膜組織置于預冷的研缽中，液氮冷凍條件下搗碎成粉末，待液氮自然揮干后，加入0.4 ml無水乙醇，研磨，再加生理鹽水1.6 ml，研磨成勻漿，3 ×103r·min－1離心 10 min，吸取上清。血清樣品測定E2和PGE2的含量，組織上清測定PGE2的含量，隨后操作嚴格按照試劑盒的要求進行。

1.4 統計學分析計量資料數據以±s表示，采用SPSS 13.0統計軟件包進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 加味佛手散對大鼠異位子宮內膜移植物體積的影響給藥4周后，模型對照組大鼠的異位子宮內膜移植物體積前后自身對照無差異;加味佛手散0.045、0.09、0.18 g·kg－1和孕三烯酮 0.5 mg·kg－1異位子宮內膜移植物體積與模型對照組相比差異有顯著性(P＜0.01)，提示加味佛手散有明顯抑制大鼠異位子宮內膜移植物體積的作用(Tab 1)。

Tab 1 Effects of Jiawei Foshousan on ectopic endometrial tissue volum size of EMS rats(±s，n=10)

Tab 1 Effects of Jiawei Foshousan on ectopic endometrial tissue volum size of EMS rats(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs model group

Group Dose Volume of ectopic endometrial tissue/mm3 Inhibition ratio Before After /%Model － 43.2 ±34.7 47.0 ±34.1 Gestrinone 0.5 mg·kg－1 40.9 ±31.8 14.0 ±12.8＊＊68.95 Jiawei 0.045 g·kg－1 36.2 ±26.5 15.8 ±12.4＊＊54.19 Foshousan 0.09 g·kg－1 49.1 ±34.2 15.1 ±13.8＊＊62.65 0.18 g·kg－1 51.1 ±35.9 17.8 ±15.6＊＊65.71

2.2 加味佛手散對大鼠異位內膜細胞HE染色形態結構的影響顯微鏡鏡下觀察移植物成活的子宮內膜組織，形成的囊壁由內向外依次為腔上皮細胞層、間質細胞層及少量纖維結締組織。模型對照組移植物的縱切面上，異位內膜有囊腫形成，囊壁厚;腺體數目多，腺體上皮細胞呈高柱狀或矮柱狀，排列在囊泡內腔面，呈多層細胞排列，細胞間連接較緊密，細胞核大，呈橢圓形，胞質豐富;內膜間質豐富，其中個別部位上皮層內陷形成假腺體。加味佛手散0.18 g·kg－1異位內膜腺上皮層明顯變薄，細胞呈矮柱狀甚至扁平狀，呈單層細胞排列，松散排列，腺腔小，未見假腺體改變(Fig 1)。

Fig 1 HE staining of in ectopic endomembrane of rats(HE×100)

2.3 加味佛手散對EMS大鼠異位子宮內膜微血管密度(MVD)值的影響Ⅷ因子陽性細胞胞質染色為棕黃色，陽性染色細胞呈黃色或棕黃色，主要是血管內皮細胞和腺上皮細胞。模型對照組陽性細胞數量多且密集，明顯高于正常組，二者差異有顯著性(P＜0.01)，顯示造模成功。加味佛手散0.18 g·kg－1和孕三烯酮0.5 mg·kg－1陽性染色細胞數量與模型組比較明顯減少(P＜0.01)，加味佛手散0.09 g·kg－1陽性染色細胞數量較模型組明顯減少(P＜0.05)，提示加味佛手散可能是通過抑制大鼠異位組織MVD而達到抑制血管生成［Fig 2A(a、b)、B(a)，Fig 2A(a、b)、B(a)］。

2.4 加味佛手散對EMS大鼠異位子宮內膜VEGF和endostatin蛋白表達的影響免疫組織化學結果顯示，VEGF和endostatin陽性細胞胞質染色為棕黃色，在異位組織腺上皮細胞及間質細胞胞質內可見陽性表達，如圖中箭頭所示。

VEGF蛋白在模型對照組中，陽性細胞數量多且密集，明顯高于正常對照組，二者差異有顯著性(P＜0.01)。加味佛手散0.18 g·kg－1和孕三烯酮0.5 mg·kg－1陽性染色細胞數量與模型組比較明顯減少(P＜0.01)，加味佛手散 0.09 g·kg－1與模型組比較明顯減少(P＜0.05)，Western blot半定量分析與上述免疫組化結果一致，提示加味佛手散可抑制大鼠異位內膜 VEGF的表達［Fig 2A(c、d)、B(b)、Fig 3、Tab 2］。

Fig 2 Immunohistochemical staining of factorⅧ、VEGF and endostatin in ectopic endomembrane of rats(SP ×400)

endostatin蛋白在模型對照組中，陽性細胞數量較少且染色較淺，明顯低于正常對照組，二者差異有顯著性(P＜0.01)。加味佛手散0.18 g·kg－1和孕三烯酮0.5 mg·kg－1陽性染色細胞數量與模型對照組比較明顯增加(P＜0.01)，Western blot半定量分析與上述免疫組化結果一致，提示加味佛手散可促進大鼠異位內膜endostatin蛋白的表達［Fig 2A(e、f)、B(c)、Fig 3、Tab 2］。

Fig 3 Western blot analysis of the effect of Jiawei Foshousan on the expression of VEGF and endostatin in ectopic endomembrane of rats

Tab 2 Effects of Jiawei Foshousan on the expression of VEGF and endostatin in ectopic endomembrane of EMS rats( ± s，n=8)

Tab 2 Effects of Jiawei Foshousan on the expression of VEGF and endostatin in ectopic endomembrane of EMS rats( ± s，n=8)

##P ＜0.01 vs control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group Dose VEGF/β-actin endostatin/β-actin Control － 0.22 ±0.04 0.024 ±0.003 Model － 0.44 ±0.03## 0.011 ±0.002##Gestrinone 0.5 mg·kg－10.24 ±0.03＊＊ 0.020 ±0.002＊＊Jiawei Foshousan 0.045 g·kg－1 0.41 ±0.02 0.012 ±0.003 0.09 g·kg－1 0.39 ±0.03* 0.013 ±0.002 0.18 g·kg－1 0.23 ±0.02* 0.021 ±0.002＊＊

2.5 加味佛手散對大鼠血清和異位內膜PGE2含量的影響放免法結果顯示，模型對照組大鼠血清和異位內膜組織中PGE2的含量與正常對照組相比明顯增高(P＜0.01)。加味佛手散0.18 g·kg－1及孕三烯酮0.5 mg·kg－1可明顯降低模型大鼠血清和異位內膜組織中PGE2的含量(P＜0.01)，加味佛手散0.09 g·kg－1與模型對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，提示加味佛手散能夠降低大鼠血清和子宮內膜中PGE2的表達(Tab 3)。

3 討論

EMS的發病機制尚不明確，比較公認的是經血逆流種植學說［5］，該學說認為有活力的子宮內膜組織和細胞在月經期間通過輸卵管到達腹部，通過酶降解和血管生成侵襲間皮細胞層和基底膜而附著于腹壁。EMS存在過度的血管生成［6］，具有類似惡性腫瘤的特征，抗血管生成治療已成為治療EMS的研究熱點［1］。血管生成是許多促進或抑制血管生成的分子參與調節的一個平衡過程［7］，VEGF是一個最重要的血管生成促進因子，可以促進血管內皮細胞的遷移和分裂增殖［8］。PGE2能提高VEGF的表達，促進血管生成［1］。endostatin是一種強效內源性血管生成抑制因子，可特異性抑制內皮細胞粘附、遷移和增殖，誘導其凋亡，發揮抑制血管生成的作用［9］。本試驗模型大鼠異位內膜組織中微血管密度、VEGF的表達較正常對照組升高，而 endostatin的表達較正常對照組降低。研究結果顯示，加味佛手散能降低大鼠異位內膜組織體積和MVD，并能夠抑制大鼠異位內膜組織中VEGF蛋白的表達，降低大鼠血清和異位內膜組織中PGE2的含量，促進endostatin蛋白的表達。

Tab 3 Effects of Jiawei Foshousan on the concentration of PGE2 in blood serum and ectopic endomembrane of EMS rats(±s，n=8)

Tab 3 Effects of Jiawei Foshousan on the concentration of PGE2 in blood serum and ectopic endomembrane of EMS rats(±s，n=8)

##P ＜0.01 vs control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

PGE 2 Group Dose Blood serum/μg·L－1 Ectopic endomembrane/ng·g －1 Control － 0.42 ±0.13 34.10 ±3.10 Model － 0.81 ±0.11## 47.61 ±5.04##Gestrinone 0.5 mg·kg－10.52 ±0.07＊＊ 35.36 ±3.57＊＊Jiawei Foshousan 0.045 g·kg－10.72 ±0.08 43.86 ±7.49 0.09 g·kg－10.68 ±0.10* 39.96 ±5.43*0.18 g·kg－10.50 ±0.10＊＊ 35.92 ±6.37＊＊

加味佛手散是由川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素3個中藥有效成分單體組成，現代藥理學研究發現［10－12］川芎嗪和阿魏酸鈉均具有抗腫瘤血管生成作用，并能抑制VEGF的表達，延胡索乙素具有抑制中樞神經系統，松弛子宮平滑肌，影響內分泌等作用［13］。課題組前期研究表明，川芎嗪和阿魏酸合用在藥代動力學方面互相影響，具有緩釋效果［14］。本研究首次報道川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素配伍合用對大鼠EMS模型的抑制作用，及其抑制異位內膜血管生長的機制。加味佛手散對雌激素的調節、免疫系統功能的影響有待于進一步研究。

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