水通道蛋白4缺失對丙泊酚催眠效應的影響

周巧梅，胡 剛，丁建花，曾因明

(1.廣州軍區廣州總醫院麻醉科，廣東廣州 510010;2.南京醫科大學神經藥理實驗室，江蘇南京 210029;3.徐州醫學院江蘇省麻醉學重點實驗室，江蘇徐州 221002)

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一類廣泛存在于真核生物細胞膜上、選擇性高效轉運水分子的特異孔道，對機體水液平衡和細胞微環境的穩定發揮重要調節作用［1］。其中，星形膠質細胞及廣泛表達其上的AQP4還通過影響神經遞質的釋放，參與調節中樞神經傳導［2］。本研究旨在通過對AQP4基因敲除小鼠的整體行為學和神經化學方面的研究，探討AQP4與全麻藥物作用的相關性。

1 材料及方法

1.1 動物、主要儀器和試劑成年同月齡♂ AQP4－/－小鼠(KO)及CD1小鼠(WT)，體質量25～30 g，由南京醫科大學神經藥理實驗室提供。小鼠腦立體定位儀為美國Stoelting公司產品。微透析泵、微透析注射器和收集器等成套設備均為美國BAS公司產品。高效液相及熒光檢測設備為日本島津公司產品。OPA購自美國Fluka公司。丙泊酚購自北京費森尤斯卡比(批號UL158，分裝批號070113)。

1.2 行為學實驗WT/KO小鼠各10只。丙泊酚200 mg·kg－1［3］腹腔注射。盲法評價小鼠翻正反射［4］:給藥至翻正反射消失記為潛伏期(TTLORR);翻正反射恢復記為持續期(DOLORR)。

1.3 微透析方法小鼠用0.2 mol·L－1水合氯醛麻醉后固定在腦立體定位儀上，根據小鼠腦立體定位圖譜［5］將微透析探頭埋置在右側前額皮層，牙托粉固定，一周后開始實驗。實驗前14 h用透析液以2 μl·min－1灌流1 h。正式實驗開始用透析液灌流平衡60 min后取樣，每20 min收集1次樣品共5次，將后3次樣品的平均值作為麻醉前基礎值，然后腹腔注射丙泊酚200 mg·kg－1，2 min后開始連續收集樣品至給藥后200 min。

1.4 高效液相色譜法應用HPLC與熒光檢測儀聯用的方法測定樣品中的GABA含量。熒光檢測器激發波長為338 nm，發射波長為 425 nm，流動相［6］流速 0.9 ml·min－1。將微透析樣品與衍生液按2∶1混合，常溫下靜置1.5 min后進樣，等度分離。

1.5 統計學處理采用SPSS 12.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 行為學實驗給藥后KO小鼠翻正反射消失的持續期時間明顯短于WT小鼠(P＜0.01)。見Tab 1。

Tab 1 The time to LORR and the duration of LORR for propofol-induced in WT/KO mice

2.2 微透析及HPLC檢測

2.2.1 基礎狀態 在基礎狀態下，WT/KO小鼠前額皮質GABA濃度分別為(0.009±0.004)μmol·L－1及(0.009±0.007)μmol·L－1，差異無統計學意義(P ＞0.05)。

2.2.2 給予丙泊酚后GABA濃度變化

2.2.2.1 給藥后 WT小鼠 GABA濃度為(0.027±0.014)μmol·L－1，KO 小鼠 GABA 濃度為(0.043 ±0.014)μmol·L－1，兩組間存在差異(P＜0.05)，且均較各自基礎狀態時增加(P＜0.01)。

2.2.2.2 WT小鼠 GABA 增加持續時間為(63.33±15.06)min，KO小鼠GABA增加持續時間為(28.01±10.95)min，KO小鼠GABA增加持續時間明顯短于WT小鼠(P＜0.05)。

2.2.2.3 兩組小鼠腦內GABA增加持續時間與各自DOLORR時間具有線性相關(r2=0.8372，P＜0.01)。

3 討論

本研究首先通過行為學實驗證實了AQP4基因缺失導致丙泊酚的催眠效應發生變化，提示AQP4在丙泊酚作用維持中可能具有重要作用。進一步通過相關腦區神經遞質測定，論證了丙泊酚誘導神經遞質釋放與其催眠效應之間的相關性，而AQP4基因參與調節該作用。從而在整體上證實了AQP4參與調節神經遞質釋放和中樞神經傳導，進而影響全麻藥物效應的發揮，豐富了全麻原理研究。

丙泊酚是具有代表性的臨床常用靜脈全麻藥，通常認為其主要作用于突觸后GABAA受體、通過增加抑制性突觸后電位而發揮麻醉效應。前額皮質是與催眠效應密切相關的目標腦區。本研究結果與既往報道的小鼠翻正反射消失伴隨腦內GABA能神經傳遞增加結果一致［7］。提示GABA能神經傳遞與丙泊酚催眠效應密切相關。而行為學研究中觀察到的AQP4基因缺失致丙泊酚催眠效應改變的現象可能系AQP4基因參與調節腦內GABA釋放所致。

綜上所述，本實驗佐證了AQP4參與神經遞質釋放，調節中樞傳導的觀點，同時發現其功能正常在全麻藥物效應發揮中的重要性，提示全麻原理不僅跟神經元突觸有關，星形膠質細胞及其上表達的多種蛋白都可能在全麻藥物效應發揮中具有一定作用。

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［5］ Franklin K B J，Paxinos G.The mouse brain in stereotaxic coordinates［M］.Orlando:Acad Press，1997:1 －208.

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