尼氟滅酸對急性低氧人肺動脈收縮的影響

楊 朝，耑 冰，張麗萍，張珍祥

(1.寧夏自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，寧夏銀川 750021;2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院呼吸病研究所，湖北武漢 430030)

低氧肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)是肺動脈高壓早期可逆性的病理改變，其發(fā)病機制尚不十分清楚。持久的HPV是低氧肺血管重建的一種啟動因子，促進肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)增殖，細胞外基質(zhì)分泌增加，血管壁增厚、硬化，形成慢性肺動脈高壓，導(dǎo)致肺心病［1］。

近期研究證實［2］，人PASMCs分布有鈣激活氯離子(calcium-activated chloride，ClCa)通道，細胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度(intracellular free Ca2+concentration，［Ca2+］i)升高可使此通道開放，使細胞外Ca2+大量內(nèi)流，進而引起平滑肌收縮;低氧可引起［Ca2+］i升高［3］，但低氧人肺動脈收縮是否與 ClCa有關(guān)研究較少。基于此，本研究運用離體血管灌流、熒光分光光度計法，觀察ClCa阻滯劑尼氟滅酸(Niflumic acid，NFA)、indaryloxyacetic acid(IAA-94)對急性低氧人肺動脈收縮的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及主要儀器二硫蘇糖醇(DTT)和4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(4-2-hydroxyethyl-1-piperazine-ethanesulfonicacid，HEPES)購 自 美 國Roche公司。膠原酶Ⅰ、小牛血清白蛋白(BSA)、苯福林(phenylephrine，PE)、NFA、IAA-94、Fura-2/AM均為美國Sigma公司產(chǎn)品。木瓜蛋白酶為武漢中健公司產(chǎn)品。其余試劑為國產(chǎn)分析純。NFA和IAA-94分別用丙酮和二甲基亞砜(DMSO)溶解制備成0.1 mol·L－1的母液。恒溫浴槽、張力傳感器(TB-653T)及生理多導(dǎo)儀均為日本Nihon Kohden產(chǎn)品，低氧培養(yǎng)箱:Galaxy R CO2Incubator，英國制造，RF-5301PC熒光分光光度計(Shimadiu)日本制造。

1.2 肺動脈平滑肌細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定根據(jù)醫(yī)學(xué)倫理委員會審批并征得患者及家屬的同意，肺動脈組織取材于18例肺癌切除術(shù)患者(男12例，女6例，平均年齡55.31歲)的癌旁肺，上述患者均無嚴重的心肺疾病。參照孔煒等［4］的方法分離肺動脈3－4級分支(直徑300～700 μm)，去內(nèi)皮并培養(yǎng)人PASMCs，細胞經(jīng)免疫細胞化學(xué) α-actin鑒定為PASMCs。

1.3 肺動脈平滑肌細胞的培養(yǎng)和分組原代培養(yǎng)細胞80% ～90%長滿瓶底即可傳代培養(yǎng)，取第2～4代生長良好的用于實驗。傳代培養(yǎng)PASMCs長至60%左右融合時，換無血清培養(yǎng)基(SFM)24 h同步化后，細胞分為7 組:① Normoxia 1:在含10 μmol·L－1蒸餾水的 SFM 培養(yǎng);② Normoxia 2:在含 50 μmol·L－1蒸餾水的 SFM 培養(yǎng);③ Hypoxia 1:在含10 μmol·L－1蒸餾水的 SFM 培養(yǎng);④ Hypoxia 2:在含 50 μmol·L－1蒸餾水的 SFM 培養(yǎng);⑤ Hypoxia+NFA1 組:在含 10 μmol·L－1NFA 的 SFM 培養(yǎng);⑥Hypoxia+NFA2 組:在含 50 μmol·L－1NFA 的 SFM培養(yǎng);⑦ Hypoxia+IAA-94 組:在含 10 μmol·L－1IAA-94的SFM培養(yǎng)。將細胞分別于常氧(37℃、5%CO2、21%O2、74%N2)及低氧(37℃、5%CO2、2%O2、93%N2)培養(yǎng)箱中分組培養(yǎng)15 min后測定［Ca2+］i(低氧前10 min分別加入工具藥或蒸餾水，參考文獻確定干預(yù)藥物的劑量［5］)。

1.4 肺動脈平滑肌細胞［Ca2+］i的測定參照Evans等［6］的方法采用熒光分光光度法測定［Ca2+］i，激發(fā)波長340 nm、380 nm，發(fā)射波長510 nm，分別加入Triton和EGTA測量最大和最小值。根據(jù)熒光比值計算，每次平行檢測6個樣品，并在測定低氧細胞時用低氧氣體預(yù)平衡。

1.5 肺動脈環(huán)的制備及血管張力的測定方法參照Evans等［6］的方法測定急性低氧對離體人肺動脈環(huán)張力的影響。將所取肺置于4℃并通有混合氣(21%O2、5%CO2、74%N2)的 PSS 液中，成分(mmol·L－1):NaCl 118，KCl 4，NaHCO310，MgSO41，NaH2PO41.2，CaCl22，HEPES 14，Glucose 5.56，5 mol·L－1NaOH調(diào) pH值到7.4，分離肺動脈3～4級分支(直徑300～700 μm)，去內(nèi)皮并將制備的血管環(huán)垂直懸掛于盛有10 ml PSS的浴槽中，溫度保持37℃，持續(xù)通以上述混合氣，連接張力換能器，記錄血管環(huán)張力變化。血管環(huán)基礎(chǔ)張力為(500±50)mg，將血管環(huán)同前分為7組，樣本數(shù)為9，工具藥或蒸餾水均為直接加入浴液中。常氧和低氧實驗時分別在浴槽中通入前述混合氣體。低氧氣體每次通入10～15 min，間隔通入常氧氣體平衡20 min。實驗結(jié)束后，將血管環(huán)置于恒溫干燥箱烘烤(溫度為60℃ ～70℃)至恒重，用電子分析天平稱量每個血管環(huán)的干重(mg)，所有張力值以實際值與標(biāo)本重量的比值計算而成(g·g－1)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理計量資料均以±s表示，成組資料的比較用t檢驗，多組資料的比較采用F檢驗。組間的兩兩比較采用q檢驗。用SPSS 12.0軟件包處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)人PASMCs的鑒定α-SM-actin免疫細胞化學(xué)染色的陽性結(jié)果，可見胞質(zhì)內(nèi)細肌絲沿細胞縱軸分布，鑒定培養(yǎng)的細胞為平滑肌細胞(Fig 1)。

2.2 鈣激活氯通道阻滯劑NFA和IAA-94對急性低氧［Ca2+］i的影響急性低氧引起［Ca2+］i升高，最高達(253.89 ±9.82)nmol·L－1(P ＜0.01);加入NFA、IAA-94使［Ca2+］i明顯降低(P ＜0.01，Tab 1)。

Fig 1 The positive expression of α-actin in human PASMCs:The buffy deposition like fine thread in the cytoplasm(DAB，×400)

Tab 1 Effects of NFA and IAA-94 on［Ca2+］iof human PASMCs in acute hypoxic condition(±s，n=6)

Tab 1 Effects of NFA and IAA-94 on［Ca2+］iof human PASMCs in acute hypoxic condition(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normoxic 1 and normoxic 2 group;##P＜0.01 vs hypoxic group 1 and hypoxic 2 group

Group ［Ca2+］i/nmol·L －1 Normoxia 1 103.26 ±4.72 Normoxia 2 106.28 ±11.07 Hypoxia 1 253.89 ±9.82＊＊Hypoxia 2 251.07 ±14.00＊＊Hypoxia+NFA1 144.52 ±4.94＊＊##Hypoxia+NFA2 109.91 ±9.96##Hypoxia+IAA-94 107.18 ±14.99##

2.3 鈣激活氯通道阻滯劑NFA和IAA-94對急性低氧人肺動脈張力的影響急性低氧引起肺動脈環(huán)收縮，最大收縮張力達(49.51±1.30)mg·mg－1(P＜0.01);加入NFA和IAA-94，它們均能抑制由低氧引起的血管收縮，引起血管舒張(P＜0.01，Tab 2)。

Tab 2 Effects of NFA and IAA-94 on acute hypoxia-evoked contraction in human pulmonary artery(±s，n=9)

Tab 2 Effects of NFA and IAA-94 on acute hypoxia-evoked contraction in human pulmonary artery(±s，n=9)

＊＊P＜0.01 vs normoxic 1 and normoxic 2 group;##P＜0.01 vs hypoxic group 1 and hypoxic 2 group

Group Vascular tension/g·g －1 Normoxia 1 4.54 ±0.52 Normoxia 2 4.43 ±0.48 Hypoxia 1 46.67 ±1.81＊＊Hypoxia 2 49.51 ±1.30＊＊Hypoxia+NFA1 28.03 ±4.65＊＊##Hypoxia+NFA2 4.50 ±0.40##Hypoxia+IAA-94 4.74 ±0.76##

3 討論

氯離子通道廣泛存在于生物膜上，目前研究較完善的有三類:一是電壓門控的ClC氯離子通道;二是受磷酸化調(diào)節(jié)的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子;三是受胞外配體結(jié)合調(diào)節(jié)的氯離子通道;另外還有目前引起眾多學(xué)者興趣的ClCa。ClCa介導(dǎo)了眾多生理過程，包括跨上皮離子與液體分泌、心肌和神經(jīng)興奮、感覺傳導(dǎo)、平滑肌收縮、腎小球細膜細胞增殖和受精過程等［7－9］。由于對其分子基礎(chǔ)尚未完全清楚，同時缺乏氯通道的高選擇性阻滯劑，使其研究大大受到限制。近兩年來，研究證實TMEM16A極有可能為ClCa的分子基礎(chǔ)，且TMEM16A mRNA在人PASMCs及其他血管平滑肌細胞高表達［2，10］，上述實驗均采用NFA等氯通道阻滯劑，實驗結(jié)果穩(wěn)定，這為進一步研究人低氧時ClCa與肺血管收縮的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

本研究證實ClCa阻滯劑NFA和IAA-94對急性低氧人肺動脈收縮有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn):急性低氧可以引起［Ca2+］i升高，這與以往的研究相同［6，11］，同時低氧引起離體肺動脈環(huán)收縮，用 ClCa阻滯劑NFA和IAA-94可以舒張低氧引起的肺動脈收縮，同時發(fā)現(xiàn)［Ca2+］i也下降。NFA抑制急性低氧人肺動脈收縮的機制尚不清楚，推測可能是:低氧使［Ca2+］i升高，激活 ClCa，引起細胞膜去極化，開放電壓依賴性鈣通道，使細胞外Ca2+大量內(nèi)流，［Ca2+］i進一步升高，進而引起平滑肌收縮;阻滯ClCa后，細胞膜去極化作用減弱，細胞外 Ca2+內(nèi)流減少，［Ca2+］i降低，肺動脈舒張。

低氧肺血管收縮是低氧肺動脈高壓發(fā)病的重要環(huán)節(jié)之一，HPV的機制目前尚未完全闡明，有兩大假說:一為介質(zhì)學(xué)說，即低氧通過釋放血管收縮劑或抑制血管擴張劑而誘發(fā)HPV，這主要與血管內(nèi)皮有關(guān);二為直接學(xué)說，即低氧直接作用于PASMCs使之發(fā)生收縮，從而誘發(fā)HPV。后者認為HPV的發(fā)生可能是低氧通過影響PASMCs的氧化還原狀態(tài)，最終抑制鉀離子通道活性，使PASMCs膜去極化，興奮性增高，引起肺血管收縮，但現(xiàn)有的鉀通道開放劑并不能完全阻止HPV的發(fā)生，故推測還有其它因素參與，如氯通道。現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)NFA可抑制急性低氧人肺動脈的收縮，其可能是通過抑制ClCa活性來實現(xiàn)的，這為進一步研究HPV的發(fā)病機制提供了新的線索，也為臨床尋找治療肺動脈高壓的藥物提供新的思路。

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