小分子肽(KP)對小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1增殖分化及NF-κB表達的影響

劉 義，吳昆鵬，楊巧珠，李延平，崔 燎

(1.廣東天然藥物研究與開發重點實驗室;2.廣東醫學院第一臨床學院，廣東湛江 524023)

小分子肽(KP)是應用本實驗室的中國發明專利技術(公開號:CN101015580)制備得到的一種小分子多肽，其相對分子質量為189～512u，具有水溶性強、生物活性強、結腸吸收率高的等特點［1］。體內實驗顯示KP能很好地預防骨質疏松［2］，但其作用機制還不明確。骨質疏松癥防治藥物臨床前有效作用研究，除需骨質疏松動物模型作藥效評價外，還需包含對成骨細胞形成促進有效或對破骨細胞吸收抑制有效的藥效研究［3］，而NF-κB信號通路在骨質疏松癥發生和發展過程中起著關鍵的作用。因此，本實驗以小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1為研究對象，通過多個指標來衡量KP對MC3T3-E1細胞增殖分化的影響，并結合NF-κB表達的變化，初步探討KP在發揮防治骨質疏松中促成骨作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 儀器二氧化碳培養箱(HERAcell 150i，USA)，ELX800 酶標儀 (Bio-tek instruments Inc，USA)，Milli Q A10 超純水器(Millipore Inc，USA)，恒溫水浴鍋(上海實驗儀器廠)，55P 72超速離心機(日本日立公司)，恒溫震蕩培養箱(哈爾濱東聯儀器廠)，DHG 9036A干燥箱(上海精宏實驗設備儀器廠)，垂直板電泳儀(北京六一廠)，轉移電泳槽(美國伯樂)。

1.2 藥物和制劑KP由廣東天然藥物研究與開發重點實驗室提供，胎牛血清(杭州四季青公司)，總蛋白提取試劑盒、Bradford蛋白定量試劑盒、增強型ECL化學發光檢測試劑盒(BestBio)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、上樣緩沖液、預染蛋白質分子量標準(碧云天生物技術研究所)，小鼠抗NF-κB p50、p60單克隆抗體、HRP標記羊抗小鼠二抗(Santa Cruz)，Dulbeccos modified Eagles medium培養基(DMEM，Gibco-BRL)，對硝基苯磷酸二鈉、噻唑藍、胰蛋白酶、β-甘油磷酸鈉、茜素紅均為Sigma公司產品，其余試劑為國產分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 MC3T3-E1細胞復蘇后，用含體積分數為10%胎牛血清的DMEM將細胞接種于培養瓶中，在37℃、5%二氧化碳及飽和濕度條件下培養。每3天更換1次培養液。細胞長滿后，用0.25%胰酶消化后傳代。

1.3.2 MTT法檢測細胞增殖 調整細胞密度為5×108·L－1，接種于 96 孔板，每孔 100 μl，24 h 后，換含不同濃度KP的DMEM培養液培養，藥物濃度分別為0.01、0.1、1、10、25、50、100 mg·L－1，對照組為不含KP的DMEM培養液，每組設8個重復孔。繼續孵育24、48、72 h，于細胞培養終止前每孔加入MTT(5 g·L－1)，孵育4 h后。吸出孔內上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩 20 min，在570 nm 波長處檢測各組吸光度(OD值)。

1.3.3 PNPP法檢測細胞中堿性磷酸酶的活性 調整細胞密度為5×108·L－1，接種于96孔板，每孔100 μl，24 h后，換含不同濃度KP的DMEM培養液培養，藥物濃度分別為 0.01、0.1、1、10、25、50、100 mg·L－1，對照組為不含KP的DMEM培養液，每組設8個重復孔，藥物作用 9、12、15、18 d后，去除培養液，用PBS清洗3次，然后每孔加入150 μl PNPP反應液(含有 25 mmol·L－1乙二醇胺、1 mmol·L－1氯化鎂和 6.7 mmol·L－1PNPP)。37℃避光孵育0.5 h后每孔加入100 μl的 0.1 mg·L－1氫氧化鈉終止反應，用酶標儀在405 nm波長處測定OD值。

1.3.4 紫外分光光度法檢測細胞中羥脯氨酸的含量 細胞按1×108·L－1接種于24孔板，每孔1 ml。24 h后，換含不同濃度KP的DMEM培養液培養，藥物濃度分別為0.01、0.1、1、10、25、50、100 mg·L－1，對照組為不含KP的DMEM培養液，每3天換培養液并加藥，每組設3個重復孔，藥物作用12、24 d后，去掉培養液，PBS沖洗3次，每孔加入濃度為150 g·L－1的三氯醋酸 1 ml，4℃放置 18 h，然后收集細胞于1.5 ml的Eppendoff管中，500×g離心5 min，去除上清液，沉淀用 6 mol·L－1的鹽酸在110℃水解24 h，揮干鹽酸后用三蒸水復溶，按照羥脯氨酸測定試劑盒說明書的要求操作，測定羥脯氨酸含量。

1.3.5 Alizarin red染色檢測礦化結節 調整細胞密度為1 ×108·L－1，接種于 24 孔板，每孔 1 ml，24 h后，換含不同濃度KP的DMEM培養液培養，藥物濃度分別為50、100 mg·L－1，對照組為不含 KP的DMEM培養液，每組設3個重復孔。藥物作用30 d后，吸去培養液，用PBS沖洗3次，經0.04甲醛于室溫下固定15 min，再用雙蒸水沖洗2遍，加入的茜素紅染色液，室溫孵育20 min并輕微振蕩，吸棄未結合的染料，用雙蒸水漂洗并振蕩5 min，重復4次，傾斜放置2 min，吸棄多余的雙蒸水，倒置顯微鏡觀察拍照記錄。

1.3.6 Western blot檢測細胞中 NF-κB p65、p50 的表達 調整細胞密度為5×108·L－1，接種于培養瓶中，24 h后，換含不同濃度KP的DMEM培養液培養，藥物濃度分別為 50、100 mg·L－1，對照組為空白的DMEM培養液。孵育 3、12、24、30 d。提取總蛋白并進行蛋白定量，用β-actin做內參，SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離蛋白，然后電轉移至PVDF膜，封閉后分別先加p65、p50抗體，二抗孵育后再加辣根過氧化物酶顯色，然后在暗室中加ECL進行X線膠片曝光，再描測灰度值。

2 結果

2.1 KP對MC3T32-E1細胞增殖的影響各濃度KP對MC3T32-E1增殖無明顯地抑制作用，25、50、100 mg·L－1KP 作用 MC3T32-E1 細胞 24、48、72 h后均能促進其增殖(P＜0.01)，結果如Fig 1。

Fig 1 The effect of KP on the cell growth of MC3T3-E1( ± s，n=8)

2.2 KP對MC3T32-E1細胞堿性磷酸酶的影響結果如 Fig 2:100 mg·L－1KP 在作用細胞 9、12、15 d后，能提高 MC3T32-E1細胞 ALP活性(P＜0.01);50 mg·L－1KP僅在9、12 d表現出此項作用(P ＜ 0.01);其他濃度(0.01、0.1、1、10、25 mg·L－1)均無增高MC3T32-E1細胞ALP活性的作用。

Fig 2 The effect of KP on the ALP activity of MC3T3-E1( ± s，n=8)

2.3 KP對MC3T32-E1細胞羥脯氨酸活性的影響不同濃度的KP作用于MC3T32-E1細胞12、24 d后，結果(Fig 3)顯示 50、100 mg·L－1KP 能提高細胞中羥脯氨酸的含量(P＜0.01);其他濃度(0.01、0.1、1、10、25 mg·L－1)均無此作用，但也無減少其含量的作用。

Fig 3 The effect of KP on hydroxyproline content of MC3T3-E1(±s，n=6)

2.4 KP對MC3T32-E1細胞礦化作用的影響A-lizarin red染色檢測礦化結節結果如Fig 4顯示:KP作用于MC3T3-E1 30 d后，與空白組比較，50、100 mg·L－1KP能明顯促進MC3T32-E1的礦化，骨結節數量明顯增多，并與劑量成正比。

Fig 4 Photographs of 30-day bone nodules in KP-treated cultures of MC3T3-E1 cells(×200)

2.5 KP 對 MC3T32-E1 細胞中 NF-κB p65、p50表達的影響50、100 mg·L－1KP 在 3、12、24、30 d均能不同程度地抑制 MC3T32-E1中 NF-κB p65、p50蛋白的表達(P＜0.01)，見Fig 5。

3 討論

小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1細胞株具有體外培養成骨細胞的各種生物學特性，是一株良好的體外培養成骨細胞株，已成為國內外公認研究藥物對成骨細胞影響有價值的體外細胞型［4－5］。我們以前的研究顯示KP能明顯增加去卵巢大鼠的骨鈣含量，使骨密度增加，能很好地預防骨質疏松癥的發生，但對其在成骨過程中的作用還不了解。國外研究表明，在卵巢切除的大鼠骨質疏松模型中，NF-κB在成骨細胞中異常的活化。正常情況下，雌激素與雌激素受體結合能抑制NF-κB的表達，在卵巢切除的骨質疏松模型中由于缺乏足夠的雌激素與雌激素受體結合導致 NF-κB 的異常活化［6－7］。因此本實驗以MC3T32-E1細胞為研究對象，檢測KP在整個成骨增殖、分化、礦化過程中對細胞的影響，同時探討在此過程中KP對MC3T3-E1 NF-κB活性的影響。

在骨形成過程中，成骨細胞的增殖分化可分為成骨細胞增殖期、細胞外基質成熟期及細胞外基質礦化期3個不同的階段，每個階段都有特定的標志物。

成骨細胞增殖期是以細胞的增殖為特征。我們的實驗結果顯示KP對MC3T32-E1無細胞毒作用，不抑制其增殖;同時中、高濃度的KP能明顯促進MC3T3-E1增殖，特別是 50、100 mg·L－1KP作用24、48、72 h后(P ＜0.01)，見 Fig 1。這證實 KP 是一種低毒且促增殖的生長促進因子。

在細胞外基質成熟期，能明顯的檢測到ALP和Ⅰ型膠原蛋白活性的特異性升高。ALP是反映成骨細胞分化早期活性的特異指標，ALP在成骨細胞分化早期處于一個上升的過程，在此過程中其表達的多少能反映出成骨細胞的分化程度和功能狀態。我們的實驗結果表明100 mg·L－1KP作用于MC3T3-E1 9、12、15 d能明顯促進其 ALP活性(P ＜0.01)，見Fig 2;Ⅰ型膠原蛋白是成骨細胞分泌的一種基質蛋白，作為骨膠原的重要組成部分為細胞外基質礦化提供支架，其反映了成骨細胞分化中期的活性。而羥脯氨酸是衡量Ⅰ型膠原蛋白價值的重要指標，通過檢測細胞中羥脯氨酸的含量能間接的反映細胞中Ⅰ型膠原蛋白的含量。50、100 mg·L－1KP在作用MC3T3-E1 24 d后能明顯地提高細胞中羥脯氨酸的含量(P＜0.01)，見Fig 3。因此，在MC3T3-E1分化成熟的早期和中期KP都能提高其分化的活性，促進骨的形成。

Fig 5 Anaysis of p65，p50 and β-actin protein expression in MC3T3-E1 by Western blot(n=3)

在細胞外基質礦化期，是以骨結節的形成及數量為特征。骨結節是分化成熟成骨細胞形成多層疊加的結節樣結構，同時骨結節是衡量成骨細胞分化晚期活性的指標。50、100 mg·L－1KP能夠促進30 d MC3T3-E1的骨結節形成(Fig 4)，從而反映KP對分化晚期的成骨細胞也有促進作用。

而NF-κB信號通路在成骨細胞的增殖分化和凋亡過程中都有著重要的作用［8］。目前研究發現，骨質疏松時，T細胞和其他細胞高度表達炎癥細胞因子如:TNF-α、IL-6、IL-1等，能促進成骨細胞中NF-κB 活化［9］，活化的 NF-κB 同時能促進 TNF-α、IL-6、IL-1 的轉錄，使其表達增加［10］，NF-κB 與炎癥細胞因子形成一個循環放大的過程。大量NF-κB的活化，能夠抑制多個成骨關鍵因子(如:Runx2、osterix、ALP、骨涎蛋白、Ⅰ型膠原蛋白)的表達和細胞外基質的礦化［11］，從而使骨形成受到抑制，導致骨質疏松癥的發生。我們的Western blot檢測結果顯示，KP能夠明顯抑制MC3T3-E1不同生長時期(3、12、24、30 d)的 NF-κB p50 和 p65 蛋白的表達(P ＜0.01)(Fig 5)。

上述實驗結果表明，KP在促進成骨細胞增殖、成骨基質蛋白ALP和I型膠原蛋白特異氨基酸(羥脯氨酸)表達、礦化結節的形成的同時能抑制MC3T3-E1細胞不同生長時期的NF-κB p50和p65蛋白表達。因此，我們推斷KP促進MC3T3-E1細胞的增殖分化可能是通過抑制NF-κB信號通路來實現的。

［1］ 李延平，鄧亦峰，吳科鋒，等.骨元肽分子量分布及大鼠在體結腸吸收的實驗研究［J］.中國骨質疏松雜志，2008，14(2):95－7.

［1］ Li Y P，Deng Y F，Wu K F，et al.A study on the distribution and absorption of Guyaung peptide's molecular weight(Mw)in the colon of rats［J］.Chin J Osteoporosis，2008，14(2):95 －7.

［2］ 李延平，劉 義，吳科鋒，等.骨元肽結腸溶膠囊對去卵巢大鼠骨質疏松癥的防治作用［J］.中國藥理學通報，2008，24(3):340－3.

［2］ Li Y P，Li Y，Wu K F，et al.The protective and therapeutic effects of colon dissolving capsule of guyuang peptide on osteoporosis in ovariectomized rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(3):340－3.

［3］ 王洪復主編.骨質疏松癥藥效研究方法與技術［M］.北京:人民衛生出版社.2009:9.

［3］ Wang H F.Methods and techniques pharmacodyamics research osteoporosis［M］.Beijing:People's Medical Publishing House.2009:9.

［4］ Nguyen H T，Yan D，Eun M C，et al.New neolignan component from camellia amplexicaulis and effects on osteoblast differentiation［J］.Chem Pharm Bull，2009，57(1):65 － 8.

［5］ 武密山，趙素芝，李 恩，等.地黃活性成分梓醇對小鼠成骨細胞MC3T3-E1增殖、分化和礦化的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(4):509-12.

［5］ Wu M S，Zhao S Z，Li E，et al.Effects of catalpol from Radix rehmanniae on proliferation，differentiation and matrix mineralization of MC3T3-E1 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(4):509-12.

［6］ Harnish D C.Estrogen receptor ligands in the control of pathogenic inflammation［J］.Cur Opin Inv Drug，2006，7:997 －1001.

［7］ Yamaguchi M，Weitzmann M N.The estrogen 17beta-estradiol and phytoestrogen genistein mediate differential effects on osteoblastic NF-kappaB activity［J］.J Mol Med，2009，23:297 －301.

［8］ Brendan F，Yao Z Q，Xing L P.Functions of nuclear factor κB in bone［J］.Ann N Y Acad Sci，2010，1192(1):367 －75.

［9］ Jimi E.Selective inhibition of NF-κB blocks osteoclastogenesis and prevents inflammatory bone destruction in vivo［J］.Nat Med，2004，10:617－24.

［10］ Xing L，Carlson L，Story B，et al.Expression of either NF-kappaB p50 or p52 in osteoclast precursors is required for IL-1-induced bone resorption［J］.J Bone Miner Res，2003，18:260 － 9.

［11］ Chang J，Z Wang，E Tang，et al.Inhibition of osteoblastic bone formation by nuclear factor-kappaB［J］.Nat Med，2009，15:682 －9.