三氧化二砷增強TRAIL殺傷人A549細胞的作用及機制研究

趙雪強，王績英，王昌明，莫碧文，蔣 明，陳 峰

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西桂林 541001)

肺癌是最常見和最難治的腫瘤之一，大多數(shù)肺癌患者確診時已是肺癌晚期，以綜合治療為主，但對放、化療不敏感，可能是與腫瘤耐藥性有關(guān)。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是新發(fā)現(xiàn)的TNF超家族成員，對腫瘤細胞具有選擇性殺傷作用而對機體正常組織不具有明顯的毒性作用［1－2］。但研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)非小細胞肺癌細胞株對TRAIL高度耐藥。三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)是傳統(tǒng)中藥砒石的主要成分，已用于白血病的治療，有學者認為還具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用。采用RT-PCR法檢測Caspase-3、Survivin mRNA在非小細胞肺癌A549細胞中的表達，并探討As2O3增強TRAIL誘導(dǎo)A549細胞凋亡的可能機制，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;TRAIL購自以色列Prospec公司，批號:207HTRAIL01;As2O3即亞砷酸氯化鈉注射液購自哈爾濱伊達藥業(yè)公司，批號:20090203;MTT購自美國Amresco;RNA提取試劑盒TRIzol Reagent Kit購自TaKaRa公司;RT-PCR System購自TaKaRa公司，引物由上海生工合成，引物序列如下:Survivin sense為5'-CCC TTT CTC AAG GAC CAC CGC ATC-3'，anti-sense為 5'-GCC AAG TCT GGC TCG TTC TCA GTG-3'，擴增產(chǎn)物長度為133 bp;Caspase-3 sense為5'-TTG GAA CAA ATG GAC CTG TTG ACC TG-3'，anti-sense 為 5'-GGA CTC AAA TTC TGT TGC CAC CTT TC-3'擴增產(chǎn)物長度為365 bp;Human actin beta sense為5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCA-3'，anti-sense 為 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'，擴增產(chǎn)物長度為243 bp。

1.2 細胞培養(yǎng)A549細胞為本實驗室自存。在5%CO237℃條件下，于10%胎牛血清、100 U·ml－1青霉素、100 mg·L－1鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)液中傳代，實驗用細胞均處于對數(shù)生長期。

1.3 MTT比色法檢測藥物體外抗瘤作用將生長活力良好的A549細胞以每孔4 000的數(shù)目加入96孔板，待細胞貼壁后分別加入 6.25、12.5、25、50、100、200 μmol·L－1的 As2O3以及 0.1、1、10、100 μmol·L－1的 As2O3聯(lián)合 TRAIL(100 μg·L－1)，每濃度設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)空白對照(僅加培養(yǎng)液)。培養(yǎng) 48 h 后，每孔加 5 g·L－1的 MTT20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加 DMSO 200 μl，震蕩 5 min，使沉淀充分溶解。用酶標儀測490 nm吸光度(A)值。分別計算As2O3組和聯(lián)合用藥組IC50值。

采用兩藥相互作用系數(shù)(coefficient of drug in inter-action，CDI)評價兩藥相互作用。CDI按下列公式計算:CDI=AB/A×B。吸光度值進行計算，AB是兩藥聯(lián)合組與對照組的比值，A、B是各藥單獨使用組與對照組的比值。如CDI＜1，證明兩藥作用性質(zhì)為協(xié)同。

1.4 流式細胞儀PI染色觀察細胞凋亡取對數(shù)期細胞接種于6孔板中，每孔4×104個細胞，培養(yǎng)12 h后，用含0.5%胎牛血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞周期同步化。后分別加入 0、1、10 μmol·L－1As2O3以及分別與100 μg·L－1TRAIL 聯(lián)用，每濃度設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞，制成單細胞，70%冷乙醇固定，4℃過夜，檢測前用PBS洗去固定液，加入20 μl RNaseA，37 ℃孵育 30 min，暗處加PI染液，冰浴30 min，以300目篩網(wǎng)過濾。調(diào)整細胞濃度為1×109·L－1后以流式細胞儀檢測，激發(fā)光源為氬離子，激發(fā)波長488 nm，用Multicycle DNA分析軟件行細胞凋亡率測定。

1.5 RT-PCR 檢測 Survivin、Caspase-3 mRNA 的表達按“1.4”中藥物濃度干預(yù)細胞48 h后，提取總RNA。總RNA提取按TaKaRa公司提供的試劑操作步驟操作。AMV第一鏈cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再經(jīng)PCR擴增。Survivin擴增條件如下:94 ℃、3 min;94 ℃、15 s，61 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35個循環(huán);72℃、5 min。Caspase-3擴增條件如下:94 ℃、3 min;94 ℃、15 s，61 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35個循環(huán);72℃、5 min。PCR產(chǎn)物用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)分析，計算相對表達量(與β-actin的比值)。

1.6 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)采用±s表示。用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，兩個獨立樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法測定對細胞生長抑制率的影響單用 As2O3組 IC50值為 42.1 μmol·L－1，聯(lián)合用藥組 IC50值為7.21 μmol·L－1。經(jīng)計算低濃度聯(lián)合組CDI值為0.99＜1，高濃度聯(lián)合組CDI值為0.94＜1。因此，As2O3具有協(xié)同TRAIL對肺癌細胞的殺傷作用。

2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡與對照組相比，As2O31、10 μmol·L－1作用 48h 后均能誘導(dǎo) A549細胞凋亡(P ＜0.05);TRAIL 100 μg·L－1則沒有統(tǒng)計學意義。同時，與單獨用藥組相比，TRAIL和As2O310 μmol·L－1聯(lián)合用藥組 A549 細胞凋亡率明顯增加(P＜0.01)。結(jié)果見Tab 1。

Tab 1 The A549 cells apoptotic ratio of each group(±s，n=3)

Tab 1 The A549 cells apoptotic ratio of each group(±s，n=3)

*P ＜0.05 vs control，△P ＜0.05 vs 1 μmol·L－1As2O3;##P ＜0.01 vs 10 μmol·L －1As2O3

Group Apoptotic ratio/%Control 0.62 ±0.20 TRAIL 100 μg·L －1 5.92 ±2.48 As2O31 μmol·L －1 13.23 ±1.99*As2O310 μmol·L －1 24.70 ±1.68*As2O31 μmol·L－1+TRAIL 100 μg·L －1 28.73 ±1.55△As2O310 μmol·L －1+TRAIL 100 μg·L －1 48.97 ±9.22##

2.3 藥物對A549細胞Survivin、Caspase-3 mRNA的表達的影響RT-PCR檢測 Survivin、Caspase-3 mRNA的表達情況見Fig 1、2，結(jié)果表明A549細胞經(jīng)As2O3、TRAIL用藥48 h后Survivin mRNA的表達明顯下調(diào)(P＜0.05);與單用藥組相比，As2O3聯(lián)合TRAIL用藥48h后Survivin mRNA的表達明顯下調(diào)(P＜0.01)。與對照組相比，單用As2O3Caspase-3 mRNA的表達明顯增強(P＜0.05)，而單用TRAIL48h后則影響沒有統(tǒng)計學意義;與單用藥組相比，聯(lián)合用藥組作用48 h后Caspase-3 mRNA的表達明顯增強(P＜0.01)。

Fig 1 The expression of Survivin in different groups.

Fig 2 The expression of Caspase-3 in different groups.

3 討論

多藥耐藥(mutidrug resistance，MDR)是影響腫瘤化療效果的重要原因。MDR的機制仍然沒有完全清楚，目前認為是由于MDR1基因編碼的蛋白、MRP基因編碼的MRP1使細胞內(nèi)的化療藥排出或分布異常，使細胞內(nèi)達不到有效藥物濃度［3－4］。但這一機制還不能完全闡明多藥耐藥。有研究表明，MDR與細胞凋亡有關(guān)。Survivin是目前發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制蛋白，具有調(diào)控細胞增殖和凋亡作用。研究發(fā)現(xiàn)Survivin和肺癌的耐藥性與疾病預(yù)后有關(guān)［5－7］。

As2O3是中藥砒石的有效成分，可以抑制細胞生長、誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制腫瘤血管生長，還可以逆轉(zhuǎn)細胞的耐藥性［8－10］。但 As2O3不是 P-gp的有效作用底物［11］。Hopkins-Donaldson 等［12］研究結(jié)果顯示，多數(shù)非小細胞肺癌細胞株對TRAIL高度耐藥。基于此，對 As2O3與TRAIL聯(lián)用在抑制A549細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的作用進行研究。

對As2O3和TRAIL作用于A549的研究中發(fā)現(xiàn)，As2O3和TRAIL對肺癌A549細胞均具有一定的抑制及誘導(dǎo)凋亡作用。兩者聯(lián)用對A549細胞具有協(xié)同抗腫瘤作用，誘導(dǎo)細胞凋亡能力明顯高于單用時的作用。TRAIL通過與其細胞表面的死亡受體結(jié)合是啟動凋亡的關(guān)鍵步驟，因此死亡受體表達量的改變將影響TRAIL的抗腫瘤作用，可能也是部分腫瘤細胞對TRAIL耐藥的原因之一，化療藥物上調(diào)死亡受體表達從而逆轉(zhuǎn)耐藥［13］。但凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)機制尚不清楚。RT-PCR檢測結(jié)果顯示As2O3聯(lián)合TRAIL用藥作用48h后均較單用藥組Survivin mRNA的表達明顯降低，Caspase-3 mRNA表達增強，并且具有濃度依賴性。

以上結(jié)果表明，As2O3通過下調(diào)Survivin，解除對凋亡通路的抑制，上調(diào)Caspase-3表達，誘導(dǎo)A549細胞凋亡。這可能是As2O3增強TRAIL對A549細胞殺傷作用的機制之一。同時As2O3具有內(nèi)在的腫瘤殺傷活性。這將為臨床應(yīng)用As2O3與TRAIL治療肺癌提供實驗依據(jù)。

(致謝:桂林醫(yī)學院科學實驗中心為實驗提供良好的科研條件和大力支持)

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