依達拉奉保護H9c2心肌細胞對抗異丙腎上腺素誘導的氧化應激及內(nèi)質網(wǎng)應激反應

黃 涌，阮經(jīng)文，楊春濤，楊戰(zhàn)利，莫利球，王秀玉，董小變，廖新學，馮鑒強，

(中山大學1.附屬第一醫(yī)院東山院區(qū)內(nèi)科;2.附屬第一醫(yī)院針灸科，3.中山醫(yī)學院生理學教研室，4.附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)麻醉科，5.附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，6.附屬第一醫(yī)院高血壓血管病科，廣東廣州 510080)

β1-腎上腺素受體(beta 1 adrenergic receptor，β1-AR)是調(diào)節(jié)心臟功能的主要受體。異丙腎上腺素(isoprenaline，ISO)是β1-AR的激動劑，在臨床上主要用于治療心臟驟停、休克及房室傳導阻滯等心血管疾病。然而，ISO能增加耗氧和耗能，持續(xù)的β1-AR興奮可產(chǎn)生心臟毒性，如氧化應激、心肌肥大、細胞壞死和凋亡等，最終導致心肌重塑和心力衰竭［1－3］。近年，有報道指出，連續(xù)應用 ISO 10 d 可上調(diào)心肌細胞內(nèi)質網(wǎng)應激蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)的表達，從而引起內(nèi)質網(wǎng)應激反應(endoplasmic reticulum stress，ERS)［4］。

依達拉奉(edaravone，EDA)是一種新型自由基清除劑，具有明顯的神經(jīng)保護作用［5－6］。自2001年起，在日本已被用于大腦缺血性疾病的治療。另有報道指出，依達拉奉可有效清除心臟組織的活性氧(reactive oxygen species，ROS)［7－8］，改善壓力負荷誘導的左心室肥大［8］，缺血/再灌注引起的心肌勞損及心肌梗死［9－10］。因此，本文推測，EDA 可能具有心肌細胞保護作用對抗β1-AR持續(xù)興奮引起的心肌毒性。為此，本文應用ISO損傷H9c2心肌細胞，旨在探討EDA能否通過抑制氧化應激及ERS來保護心肌細胞對抗ISO引起的損傷，為深入闡明EDA的心肌保護作用提供新的實驗資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑ISO由上海禾豐制藥有限公司提供，EDA由南京先聲東元制藥有限公司供給，GRP78兔抗大鼠多克隆抗體購自美國Bioworld生物技術公司，N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)、雙氯熒光素(2'，7'-dichlorfluorescein-diacetate，DCFH-DA)和羅丹明 123(rhodamine123，Rh123)購自美國Sigma-Aldrich公司，CCK-8試劑盒購自日本Dojindo Lab，DMEM-F12培養(yǎng)基購自Gibco公司。H9c2心肌細胞由中山大學實驗動物中心提供。

1.2 細胞培養(yǎng)H9c2心肌細胞株來源于大鼠胚胎期心臟組織，在37℃、5%CO2的條件下，培養(yǎng)于含有15%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中。

1.3 細胞存活率的檢測H9c2心肌細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，當細胞生長到培養(yǎng)孔的約85%面積時，根據(jù)實驗需要給予不同的處理因素，處理結束后，每孔加入10 μl CCK-8，輕搖，37℃孵育3 h，用酶標儀(λ=450 nm)記錄各孔的吸光度(OD)。取4孔OD值的平均數(shù)，按公式計算細胞存活率，細胞存活率/%=處理組OD/對照組OD×100%，重復3次。

1.4 細胞內(nèi)ROS含量的檢測DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜。進入細胞后，可被細胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH，而DCFH不能自由通透細胞膜，從而將探針裝載到細胞內(nèi)。細胞內(nèi)的ROS可將無熒光的DCFH氧化成發(fā)出綠色熒光的DCF。綠色熒光的強弱可以間接反映細胞內(nèi)ROS的水平。將H9c2心肌細胞均勻地接種于直徑為35 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)。當細胞生長到培養(yǎng)孔的約80%面積時，給予不同的處理因素，每組均包括3個復孔。處理完成后，用無血清培養(yǎng)基漂洗蓋玻片3次，用10 μmol·L－1DCFH-DA染液于37℃孵育60 min。在熒光顯微鏡下隨機選取5個不重復區(qū)攝片，用ImageJ 1.41o軟件分析5個視野綠色熒光強度的平均值，再對每組的各樣本進行統(tǒng)計分析。

1.5 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的檢測Rh123是一種能夠被線粒體所吸收的熒光染料，線粒體對其攝取能力取決于其跨膜電位。根據(jù)熒光強度可以間接反映MMP的高低。將H9c2心肌細胞均勻地接種于直徑為35 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，每組均包括3個復孔。處理完成后，用 PBS 洗3 次，在含100 μg·L－1Rh123 的無血清培養(yǎng)基中37℃孵育45 min，熒光顯微鏡下隨機選取5個不重復區(qū)攝片，細胞核周圍綠色的亮點即為攝取了Rh123的線粒體。用ImageJ 1.41o軟件分析5個視野的綠色熒光強度平均值，再對每組的各樣本進行統(tǒng)計分析。

1.6 Western blot法檢測蛋白的表達H9c2心肌細胞被接種于35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，在各處理因素作用后，用預冷的PBS洗2次，加入65 μl細胞裂解液，4℃靜置 30 min。12 000 r·min－1離心 10 min，取上清，用BCA法進行蛋白定量。總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。隨后加入1∶3 000稀釋的兔抗大鼠的GRP78抗體，4℃輕搖過夜，用TBST洗3次，加入相應的二抗，室溫孵育1 h，漂洗3次。ECL顯色后，用ImageJ 1.41o軟件進行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有結果以±s表示，組間比較采用One-way ANOVA及LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 ISO劑量依賴性地降低H9c2心肌細胞存活率Fig 1顯示，H9c2心肌細胞經(jīng)20～100μmol·L－1濃度的ISO處理48 h后，細胞存活率呈劑量依賴性地降低(r= －0.97)。其中40和60 μmol·L－1組分別與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)，而 80 和 100 μmol·L－1組分別與對照組比較差異明顯(均P＜0.01)。

Fig 1 Effect of ISO on cell viability in H9c2 cells(±s，n=3)

2.2 EDA及NAC抑制ISO誘導的H9c2心肌細胞存活率降低Fig 2A顯示，在80 μmol·L－1處理H9c2心肌細胞48 h前，分別給予10～40μmol·L－1濃度的EDA預處理1 h，可以劑量依賴性地抑制ISO引起的細胞存活率降低;另外，為了進一步探討EDA的心肌細胞保護作用是否與抗氧化有關，通過應用常用的自由基清除劑NAC預處理H9c2心肌細胞1 h，結果顯示(Fig 2B)，NAC 在500～2 000μmol·L－1的濃度范圍內(nèi)，也可保護心肌細胞對抗ISO引起的活力降低。EDA和NAC本身對細胞活力均無明顯地影響。

2.3 EDA抑制ISO引起的細胞內(nèi)ROS水平的升高Fig 3顯示，80 μmol·L－1ISO 處理 H9c2心肌細胞12 h可使細胞內(nèi)ROS明顯升高，而在ISO處理前給予40 μmol·L－1EDA 預處理 1 h，可明顯降低ISO引起的細胞內(nèi)ROS水平的升高。EDA本身對細胞內(nèi)ROS水平無影響。

Fig 2 Effect of EDA and NAC on ISO-induced decrease in viability in H9c2 cells(±s，n=3)

2.4 EDA抑制ISO引起的MMP丟失Fig 4顯示，正常H9c2心肌細胞可攝取Rh123，熒光顯微鏡下表現(xiàn)為細胞核周圍亮綠色的熒光(對照組)，當細胞被80 μmol·L－1的 ISO 處理24 h后，細胞內(nèi)亮綠色的熒光明顯減弱，提示MMP丟失(ISO組)。在用ISO 處理前給予40 μmol·L－1EDA 預處理 1 h，可明顯抑制ISO引起的MMP的丟失。EDA本身對MMP的影響無統(tǒng)計學意義。

2.5 EDA抑制ISO對內(nèi)質網(wǎng)應激蛋白GRP78表達的上調(diào)作用為了明確EDA的心肌細胞保護作用是否與抑制內(nèi)質網(wǎng)應激反應有關，通過檢測內(nèi)質網(wǎng)應激蛋白 GRP78的表達發(fā)現(xiàn)，80μmol·L－1ISO可時間依賴性地上調(diào)GRP78的表達，ISO作用6 h開始升高，12 h達到高峰(Fig 5 AB)。在80μmol·L－1ISO 處理12 h 前，給予40 μmol·L－1EDA 預處理1 h，可明顯下調(diào)GRP78的表達(P＜0.01)，提示EDA可抑制ISO誘導的內(nèi)質網(wǎng)應激反應。EDA本身對GRP78表達的影響無統(tǒng)計學意義(Fig 5 C、D)。

Fig 3 Effect of EDA on ISO-induced ROS accumulation in H9c2 cells(±s，n=3)

3 討論

本文證實，應用ISO處理H9c2心肌細胞48 h可呈濃度依賴性地降低細胞存活率，提示ISO引起的β1-AR持續(xù)興奮對心肌細胞具有毒性損傷作用。同時，ISO也可引起心肌細胞內(nèi)ROS水平升高及MMP降低。臨床和基礎實驗研究表明，過多的ROS能引起氧化應激反應，從而損傷心肌細胞;ROS生成增多也能導致線粒體功能障礙，例如MMP丟失，細胞色素C釋放等［11］。因此，ISO對H9c2心肌細胞的損傷機制之一可能與其誘發(fā)氧化應激有關。另方面，ISO能時間依賴性地上調(diào)H9c2心肌細胞內(nèi)GRP78的表達。GRP78是一種內(nèi)質網(wǎng)應激蛋白，是ERS的標志之一［12］。本文的結果提示ISO可誘導H9c2心肌細胞產(chǎn)生ERS，這與周昌清等［4］的研究相似。

Fig 4 Effect of EDA on ISO-induced MMP loss in H9c2 cells(±s，n=3)

Fig 5 Effect of EDA on ISO-induced up-regulation of GRP78 expression in H9c2 cells(±s，n=3)

盡管有學者報道依達拉奉可保護心肌細胞對抗缺血/再灌注引起的損傷［13］，但是，其能否對抗β1-AR持續(xù)興奮引起的心肌細胞損傷尚未見報道。本文觀察到，依達拉奉預處理可明顯對抗ISO引起的心肌毒性損傷，使細胞存活率升高，表明依達拉奉可保護心肌細胞對抗ISO誘導的心肌損傷。由于臨床上一些心力衰竭的發(fā)病與β1-AR過度興奮有關，所以，本文為臨床應用依達拉奉防治與β1-AR過度興奮有關的心力衰竭提供了新的實驗依據(jù)。

重要的是，本文證實，依達拉奉在保護H9c2心肌細胞對抗ISO誘導的細胞毒性的同時，能抑制ISO引起的ROS生成增多及MMP降低，提示依達拉奉可通過抑制氧化應激及改善線粒體功能途徑發(fā)揮心肌保護作用。Watanabe 等［7］和 Tsujimoto 等［8］也發(fā)現(xiàn)依達拉奉可清除心臟的ROS，這為本文的研究提供了重要的依據(jù)。另外，本文還觀察到，依達拉奉能對抗ISO對GRP78表達的上調(diào)作用，提示依達拉奉可抑制ISO誘導的ERS。ERS是應激后細胞內(nèi)的初始反應，是線粒體應激等細胞應激反應的共同初始通路。現(xiàn)已證實，持續(xù)的ERS是促進細胞凋亡的重要機制，是介導細胞凋亡的三條重要通路(即死亡受體通路、線粒體通路和內(nèi)質網(wǎng)通路)之一。在大鼠自身免疫性心肌炎模型，Shimazaki等［14］觀察到，依達拉奉可通過抑制ERS來減少心肌細胞凋亡，這與本文的實驗結果相一致。

綜上所述，本文證實ISO可降低H9c2心肌細胞存活率，并促進 ROS生成和內(nèi)質網(wǎng)應激蛋白GRP78表達及抑制MMP。依達拉奉能保護H9c2心肌細胞對抗ISO引起的損傷，其心肌保護作用可能與抑制氧化應激反應及內(nèi)質網(wǎng)應激蛋白GRP78表達有關。

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