溫郁金中新二萜類化合物C誘導人結腸腺癌SW620細胞凋亡的相關通路研究

沈 雁，呂 賓，張 爍，馬忠俊

(1.浙江中醫藥大學附屬第一醫院消化內科，浙江 杭州 310006;2.浙江大學藥學院現代中藥研究所，浙江 杭州 310058)

結腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，在世界范圍內，其發病率和死亡率呈逐年上升趨勢［1-2］。鑒于其早期診斷策略尚不成熟，以及放化療毒副作用所造成的臨床應用限制，因此研發傳統中藥材中潛在高效的抗癌活性成分不失為對抗結腸癌的一個新選擇。

溫郁金是姜科姜黃屬植物溫郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥塊根。研究表明，它具有降脂、護肝、抗腫瘤、抗輻射等廣泛的藥理活性［3］。近年來，溫郁金的抗腫瘤效應日益受到關注:研究發現其多種提取液在體內外均能抑制胃癌的形成和發展;其醇提物中的姜黃素和其醚提物中的欖香烯已被證實為顯效的抗癌成分。在此基礎上，筆者進一步從其醚提物中分離得到另一種全新的二萜類化合物C。本實驗擬觀察該化合物C對人結腸腺癌SW620細胞增殖、凋亡的影響及相關信號通路蛋白表達及活性的變化，來闡述其抗癌作用的生物學機制，為尋找有效的結腸癌治療藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器溫郁金二萜類化合物C由浙江大學藥學院現代中藥研究所分離提供［4］，其分子量為380，分子式為C22H36O5。

5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)注射液由天津金耀氨基酸有限公司提供(批號:0910221，分子量:130.08)。Leibovitz’s L-15 培養基及 0.25% 胰酶均為杭州吉諾公司產品;胎牛血清購自北美Gibco公司;MTT(噻唑藍)干粉購自Ameresco公司;AnnexinV/PI凋亡試劑盒購自Biouniquer公司;兔抗p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、caspase-3 及β-actin均為Cell Signaling公司產品;抗兔二抗及抗鼠二抗為Jaskson公司產品。CO2培養箱(Thermo)、生物安全操作柜(Thermo)、流式細胞儀(BD)、離心機(Thermo)、電泳儀(BD)、半干半濕轉膜儀(BD)等用于本實驗。

1.2 實驗細胞系和培養條件人結腸腺癌細胞(SW620)株購自中國科學院院上海細胞庫，生長于含10%胎牛血清的L-15培養基中，置37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中常規培養。實驗時取對數生長期細胞。

1.3 噻唑藍還原法(MTT法)檢測細胞增殖抑制情況細胞傳代并接種于96孔培養板中，每孔10 000個細胞，200 μl，孵育 24 h 后吸棄上清液，每孔加入含化合物C的L-15培養液200 μl，使終濃度分別為10、20、40 和 70 mg·L-1;設陰性對照組(僅培養液干預)和空白對照組(不含細胞的血清培養基)，陽性對照組每孔加入含5-Fu的培養液200 μl，使其終濃度同化合物C(每個劑量設3個重復孔)。繼續孵育24、48和72 h，實驗終止前4 h添加5 g·L-1的 MTT液20 μl后再培養4 h，棄上清并加入DMSO 150 μl，上微量振蕩器振蕩 10 min，立刻用酶標儀測定吸光度值(A)，檢測波長為570 nm。計算細胞生長抑制率。抑制率/%=［(陰性對照組A-空白對照組A)-(實驗組A-空白對照組 A)］/(陰性對照組A-空白對照組A)×100%。

1.4 FCM檢測細胞凋亡情況細胞培養并接種于中號培養皿中，每個培養皿6×105·L-1，3 ml，培養24 h后換成含化合物C的培養液3 ml干預，設40、55、70 mg·L-13個終濃度的實驗組及陰性對照組，陽性對照組為相同濃度梯度的5-Fu組，每組重復3次。培養12、24、48 h和72 h后，用不含EDTA的胰酶消化細胞，PBS漂洗 2次(2 000 r·min-1，5 min)，并用 500 μl的 Binding buffer懸浮細胞，再加入5 μl Annexin V-FITC混勻，室溫、避光、反應5～15 min后，上機檢測。

1.5 Wester blot檢測蛋白表達將對數生長期細胞 1 ×106個分別以 0、40、55、70 mg·L-1化合物 C作用48 h后，用0.25%胰酶消化、PBS漂洗，再加入150 μl新鮮配置的 RIPA裂解液，放冰上裂解30 min，4℃ 12 000 r·min-1離心 10 min，收集上清液，用Bradford法測定蛋白含量;各濃度組的蛋白均取30 μg，加等體積上樣 Buffer混合，100℃變性 5 min后，以每孔20 μl的上樣體積加入12%的分離膠和5%的濃縮膠中進行SDS-PAGE電泳，之后用半干半濕轉膜儀250 mA電轉2.5 h將蛋白轉移到PVDF膜上;用含 5%BSA 的 TTBS(0.1%Tween-20，10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol·L-1NaCl)4℃封閉過夜;分別用抗 ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、caspase-3、β-actin 的一抗和相應二抗孵育，TTBS洗膜3次，每次10 min;最后用增強化學發光法(ECL)檢測陽性信號，顯影后根據彩色標準電泳指示條帶(marker)中的位置來分析各電泳條帶的性質。

1.6 統計學分析數據用SPSS 17.0統計軟件包分析，結果用±s表示，兩組間均數比較用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Least-Significant Difference(LSD)法。

2 結果

2.1 MTT測定結果二萜類化合物C及5-Fu在10、20、40 和70 mg·L-1的終濃度時對 SW620 細胞的增殖均呈時間-濃度依賴性的抑制作用(Fig 1);化合物C作用24、48和72 h后的半數有效抑制濃度(IC50)分別為 29.75、15.91 和 6.55 mg·L-1;各時間段、各濃度的化合物C對SW620的抑制率均較同時間、同濃度的5-氟脲嘧啶為高(P＜0.01)。

2.2 FCM測定結果兩種藥物均能不同程度地誘導SW620細胞發生凋亡，其中化合物C的促凋亡效應呈明顯的時間-濃度依賴性(Fig 2);作用12 h，40和55 mg·L-1化合物C組與同濃度5-FU組的凋亡率間比較，差異無統計學意義;此外各時間段、各濃度時，化合物C的促凋亡作用均強于5-FU(Tab 1，P ＜0.01)。

Tab 1 Apoptosis rate of SW620 cells induced by diterpenoid C and 5-FU(±s，n=3)

Tab 1 Apoptosis rate of SW620 cells induced by diterpenoid C and 5-FU(±s，n=3)

＊＊P ＜0.01 vs 5-Fu group;▲▲P ＜0.01 vs control group

Concentration/mg·L-1 Diterpenoid C/%5-FU/%.04 ±0.842 40 5.40±0.374▲▲ 15.66±0.459▲▲＊＊ 34.22±1.317▲▲＊＊ 50.71±1.803▲▲＊＊ 4.14±0.500▲▲ 8.63±0.551▲▲ 9.11±0.565▲▲ 44.72±1.461▲▲55 9.08±0.906▲▲ 42.11±0.930▲▲＊＊ 61.83±0.794▲▲＊＊ 88.54±2.273▲▲＊＊ 11.40±0.816▲▲ 17.94±1.010▲▲ 44.30±1.855▲▲ 56.53±1.881▲▲70 28.15±1.090▲▲＊＊67.80 ±0.931▲▲＊＊ 81.40±1.692▲▲＊＊ 98.20±0.910▲▲＊＊ 18.25±0.641▲▲ 35.89 ±1.235▲▲ 63.38±0.245▲▲ 82.76 ±1.981 12 h 24 h 48 h 72 h Control 0.35±0.085 3.17 ±0.285 4.01±0.721 9.04±0.842 0.35±0.085 3.17 ±0.285 4.01±0.721 9 12 h 24 h 48 h 72 h▲▲

2.3 Western blot檢測結果與陰性對照組相比，化合物C干預組的ERK、JNK及p38 MAPK的表達水平均受到抑制;而三者相應的磷酸化水平，即p-ERK、p-JNK和p-p38的表達則受到更為明顯的抑制;相反，caspase-3的蛋白量則呈上調趨勢(Fig 3，P＜0.01)。上述蛋白的抑制/活化效應均表現出劑量依賴性的特點。

3 討論

結腸癌的發生發展是一個多基因參與、涉及多階段演變的復雜過程。在外界致癌信號的過度刺激下，相關轉導通路中關鍵效應子發生異常的激活/失活，引起下游原癌基因和抑癌基因的表達失衡，進而導致腸上皮細胞表型的轉變。癌轉的細胞能逃避生理性凋亡點的監控而達到永生化，同時還獲得對周圍組織、器官的高侵襲力。因此，誘導腫瘤細胞凋亡將是治療結腸癌的一條積極有效的途徑［5］。

溫郁金是臨床常用的傳統中藥材，目前國內外對其有效成分的研究主要集中于姜黃素和欖香烯，并已證實這兩種成分具有良好的抗癌活性［6-8］。我們的前期研究結果顯示，［9-11］溫郁金的水提物、醚提物和醇提物在體內外均能抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖，且后兩者尚具有良好的凋亡誘導效應，其作用機制可能與下調血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、環氧合酶-2(cycloxygenase-2，COX-2)的水平以減少瘤灶內微血管密度(microvessel density，MVD)、提高血漿和組織中生長抑素(somatostatin，SS)的表達、抑制胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)Ⅰ和Ⅱ的分泌等有關。為深入了解并開發溫郁金中潛在的其他抗癌活性成分，我們成功地從其醚提物中提取出一種新型二萜類化合物C，其化學結構和性質都有別于姜黃素和欖香烯。通過本次實驗發現，該化合物C能以時間-濃度依賴性的方式抑制人結腸腺癌SW620細胞的增殖，并誘導凋亡，從而逆轉癌細胞本身存在的生長失控、凋亡失能特性，表現出高效的抗癌活性，且其對結腸腺癌細胞的毒性作用明顯高于臨床上常用的化療藥物5-Fu。

絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路是細胞信號轉導網絡中的重要成員之一，它能通過高度保守的“瀑布樣”磷酸化級聯反應將細胞外刺激與細胞內基因表達和胞質功能活動連接起來，參與細胞的增殖、分化、運動、凋亡等多種生命活動。目前在哺乳動物細胞中鑒定出了3條主要的亞通路，即細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular-signal regulated kinase，ERK)通路、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/應激活化蛋白激酶(stress activated protein kinase，SAPK)通路和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)通路，已被證實在包括結腸癌在內的多種消化系腫瘤中存在異常表達或活化，提示其與腫瘤的發生發展間存在密切聯系［12-14］。其中ERK通路主要接受有絲分裂原的刺激，活化后能促進細胞增殖、分化、骨架重構等，與腫瘤細胞的惡性生物學行為間關系密切［15］;JNK和p38通路則主要接受各種應激和病理性損傷信號，有時也可被有絲分裂原所活化，產生的效應在很大程度上取決于信號類型和(或)自身亞型的不同，可以表現為促進凋亡或抵抗、修復損傷這兩種截然相反的結果［16］。Caspase-3是凋亡經典通路的下游蛋白元件，被活化后則成為最關鍵的凋亡執行者，能促進絕大多數凋亡事件的開啟［17］。我們的實驗結果顯示，化合物C能濃度依賴性地抑制ERK、JNK和p38的水平，而對三者磷酸化的抑制程度更為顯著;相反，它能明顯誘導活性caspase-3的蛋白表達。推測化合物C可通過下調ERK通路介導的分裂生存效應、抑制JNK/p38通路介導的細胞保護效應，同時傳遞活化信號至凋亡效應子caspase-3，進而誘導人結腸腺癌SW620細胞發生凋亡。

Fig 1 Inhibitory effects of diterpenoid C and 5-FU on the proliferation of SW620 cells(±s，n=3)

Fig 2 Flow cytometry analysis for apoptosis of SW620 cells induced by diterpenoid C( ± s，n=3)

Fig 3 Effects of diterpenoid C on MAPK signaling pathway and caspase-3 in SW620 cells treated for 48 h(±s，n=3)

綜上所述，溫郁金醚提物中的二萜類化合物C是一種新型的抗癌活性成分，其誘導的人結腸腺癌細胞凋亡可通過抑制MAPK存活途徑、激活caspase-3凋亡途徑而實現。本研究結果在一定程度上展示出溫郁金醚提物中二萜類化合物C在結腸癌臨床治療中的廣闊前景，并將為后續更為深入的系列研究奠定理論基礎。

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