CD44抗體HI44a對急性髓系白血病細胞株HL-60細胞體外增殖、分化作用的研究

宋清曉，吳 勇，陳元仲

(福建省血液病研究所，福建醫科大學附屬協和醫院，福建福州 350001)

急性白血病是造血系統的惡性疾病，其特征是造血細胞增殖失控、分化障礙和凋亡受阻。白血病細胞可自發產生一些細胞因子，通過自泌環節作用于細胞本身的增殖、分化、凋亡。已知造血因子主要可分為兩大類。一類是正性造血細胞因子，如SCF、IL-1、IL-3、IL-6、IL-8、IL-11、G-CSF、GM-CSF、EPO、TPO等;另一類是負性造血細胞因子，主要有TGF-β1、TNF-α和IFNγ等。CD44分子是一種分布廣泛的細胞表面黏附分子，包括CD44S和CD44V，是細胞與細胞、細胞與ECM相互識別和作用的分子基礎，參與細胞間的黏附、淋巴細胞的活化、淋巴細胞歸巢或再循環、細胞的運動及細胞內外的信號傳導。由于CD44分子本身的生物學功能特性，決定了其可能成為一個治療急性髓系白血病的優秀藥物靶點。而骨橋蛋白(osteopontin，OPN)作為CD44的配體，特異性地識別CD44V6，它參與了某些腫瘤細胞的侵襲、擴散和轉移過程，但CD44抗體誘導急性髓系白血病原始細胞分化的過程中，OPN如何變化及起什么作用均未見報道。HI44a(IgG2a)是一種鼠源性的抗CD44單克隆抗體，其結合位點位于CD44分子胞外區臨近透明質酸結合位點處。本實驗研究HI44a對急性髓系白血病細胞株HL-60的體外增殖與分化作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養條件HL-60細胞株系本所所藏，全反式維甲酸(ATRA，Sigma公司，美國)，CD44單克隆抗體HI44a(IgG2a，協和干細胞基因工程公司)。培養條件:含體積分數為0.10的滅活胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)、置37℃、體積分數5%CO2飽和濕度的培養箱培養，隔日半量換液，存活細胞百分率(臺盼藍拒染法)＞95%。

1.2 HI44a對HL-60細胞增殖的影響取處于對數生長期的HL-60細胞重懸于體積分數為10%的滅活胎牛血清的RPMI 1640培養液中，分成HL-60、HL60+HI44a、HL-60+ATRA共3組，分別種于96孔培養板，細胞濃度為1×108·L－1，HI44a終濃度為 40 mg·L－1，ATRA 終濃度為 1 μmol·L－1。置37℃、體積分數5%CO2飽和濕度的培養箱培養，培養24、48、72、96 h后分別取細胞懸液用臺盼藍染色后計數活細胞數。取3孔平均值，以時間為橫坐標，活細胞數為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

1.3 HI44a對HL-60細胞分化的影響取對數生長期HL-60細胞2×108·L－1加入終濃度為40 mg·L－1的HI44a，同時設置陰性及陽性對照組，分別加入終濃度為10 mg·L－1的 IgG2a和終濃度為1 μmol·L－1的 ATRA，置 37℃培養(條件同上)，于96 h收集細胞。

1.3.1 細胞形態學檢查HI44a處理HL-60細胞前后細胞形態的變化 收集HL-60細胞及HI44a、ATRA處理96 h的HL-60細胞離心，涂片，晾干后行瑞氏染色，普通光學顯微鏡油鏡下觀察細胞形態的變化。

1.3.2 流式細胞學檢測HI44a處理HL-60細胞前后細胞表面分化抗原CD11b、CD15的表達變化 取5 ×108·L－1培養后細胞，PBS 洗兩次，加入20 μl熒光標記的鼠抗人CD11b或CD15抗體(BD公司)，同時以FITC標記的IgG2a作為同型對照，4℃孵育30 min，PBS洗滌后，流式細胞儀檢測并分析。

1.4 RT-PCR檢測HI44a處理HL-60細胞前后TGFβ1、TGFβR1的表達收集各組細胞，提取總RNA，準確定量后合成cDNA，PCR擴增反應體系20 μl，含 cDNA 1 μl，2 × Tag PCR MasterMix 10 μl(TIANGEN)，上、下游引物各0.5 pmol，置 DNA擴增儀(2400型，PE公司)擴增。同時以β-肌動蛋白(β-actin)的mRNA擴增作為內參照。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析儀分析。

1.5 熒光定量 RT-PCR 法檢測 OPN、IL3-Rα、GM-CSFRα、HβC mRNA的表達收集各組細胞，提取總RNA，準確定量后合成cDNA，再采用SYBR Green(BD公司)進行定量PCR，總反應體系20 μl，含 2 × SYBR Green PCR Mix 9 μl，上、下游引物各0.5 pmol，cDNA 2 μl。熒光定量 PCR 結果采用相對定量法=2－△△CT分析。反應體系及反應參數、各基因引物及PCR參數，見Tab 1。

Tab 1 The sequences of primers，the sizes of amplified fragments，the annealing temperatures and cycles for PCR

1.6 DNA序列分析檢測HI44a處理HL-60細胞前后OPN異構體的變化

1.6.1 PCR 反應 總反應體系 50 μl，采用高保真酶(platinum Taq DNA polmerase high fidelity)，反應體系如下:10 × High fielidty Buffer 5 μl，2.5 mmol·L－1each dNTP Mix 4 μl，50 mmol·L－1MgSO42 μl，上、下游引物各 1 pmol，Platium Taq 0.2 μl，cDNA 3 μl。OPN編碼區序列上游引物為:5'-TGCAGCCTTCTCAGCCAAAC-3'，下游引物 為:5'-TTACAGGGAGTTTCCATGAAGCC-3'。擴增條件:94℃預變性2 min 后，94℃變性 30 s，58℃退火 30 s，68℃ 延伸 2 min，共35個循環，再68℃延伸7 min。擴增產物長度為1 200 bp。

1.6.2 OPN PCR產物純化及測序 回收PCR產物按割膠回收試劑盒(General Electric Company)說明書進行，將純化產物連接至T載體上(Promega公司產品)，將所連接產物轉化至感受態大腸桿菌JM-109細胞，用牙簽挑取數個白色菌落，采用PCR方法鑒定，擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳可見目的基因擴增帶，將HL-60組、HI44a及ATRA組各挑取8個菌落加5 ml含氨芐的LB液體培養基，37℃振搖過夜，按(General Electric Company)試劑盒提取質粒DNA，在紫外分光光度儀上準確定量后進行測序反應，總反應體系 10 μl，含 Big Dye terminator Mix 1.0 μl，5 × buffer 1.5 μl，1 pmol引物 1.6 μl，質粒 DNA 300 ng。反應條件:96℃預變性2 min后，96℃變性20 s，50℃退火 10 s，60℃延伸 4 min，共 25 個循環。將測序反應產物純化后跑測序膠，計算機分析結果。

1.7 ELISA法檢測各實驗組培養基上清中的OPN水平OPN ELISA檢測試劑盒購自美國R＆D公司，按照試劑盒說明書操作。

1.8 統計學處理統計學分析采用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以±s表示，組間均值比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 HI44a對HL-60細胞增殖的影響HI44a組HL-60細胞增殖受抑制，但不如ATRA明顯。

2.2 HI44a對HL-60細胞分化的影響

2.2.1 HI44a處理HL-60細胞前后細胞形態變化HL-60細胞與40 mg·L－1的HI44a共培養后，細胞表現為體積變大、核固縮、核質比例降低、核仁減少、出現核分葉等往成熟細胞分化的表觀特征。見Fig 2。

2.2.2 HI44a處理HL-60細胞前后細胞表面分化抗原的表達變化 (1)HI44a作用后，CD15表達上調，但不如ATRA組明顯，CD11b表達無明顯改變。結果見Tab 2。

Fig 1 Effects of HI44a on the proliferation of HL-60 cells

Fig 2 Effects of HI44a on the differentiation of HL-60 cells(HP×200)

Tab 2 The levels of CD15 and CD11b detected by flow cytometry in the HL-60 group，HI44a group and ATRA group

2.2.3 RT-PCR 檢測各組細胞 TGF-β1、TGF-βR1 mRNA表達水平 HL-60細胞在與HI44a共同培養96 h 后，TGF-β1mRNA 表達增高，TGF-βR1 表達水平無明顯變化。見Fig 3、4。

2.2.4 熒光定量RT-PCR法檢測HI44a誘導HL-60分化過程中表達 OPN、GM-CSFRα、HβC 、IL3-RαmRNA的變化，結果采用相對定量法 =2－△△CT分析，結果顯示經HI44a處理的HL-60細胞OPN表達下調，GM-CSFRα表達上調。見Fig 5、6。

與HL-60組比較，HI44a組OPN mRNA表達下調0.60倍，ATRA組OPN mRNA表達下調0.69倍，IgG2a組OPN mRNA表達上調1.07倍，結果見Fig 5。

Fig 3 Expression of TGF-β1mRNA in HL-60 group，HI44a group and ATRA group detecded by RT-PCR

Fig 4 Expression of TGFβR1 mRNA in HL-60 group，HI44a group，IgG2a control group and ATRA control group detecded by RT-PCR

Fig 5 Expression of OPN mRNA in HL-60 group，HI44a group，IgG2a control group and ATRA control group detecded by fluorescence quantitative PCR

與 HL-60組比較，HI44a組GM-CSFRα mRNA表達上調4.63倍，ATRA組GM-CSFRα mRNA表達上調3.48倍，IgG2a組GM-CSFRα mRNA表達上調2.09倍，結果見Fig 6。

Fig 6 Expression of GM-CSFRα mRNA in HL-60 group，HI44a group，IgG2a control group and ATRA control group detecded by fluorescence quantitative PCR

2.3 OPN基因序列分析結果DNA序列分析OPN存在3種分子量大小不同的異構體，與基因庫比對，分別為 isoform A、isoform B、isoform C。isoform A為314個氨基酸組成的蛋白質，isoform B為300個氨基酸組成的蛋白質，isoform C為287個氨基酸組成的蛋白質。各組測序結果見Tab 3。

Tab 3 The composition of three osteopontin isoforms studied by full-length cDNA of osteopontin sequence analysis

2.4 實驗組與對照組細胞培養基中的OPN水平比較HI44a組OPN水平明顯低于HL-60組及IgG2a組，結果見Tab 4。

Tab 4 The level of osteopontin

3 討論

急性白血病是造血干細胞的惡性克隆疾病，目前西醫多采用化療、骨髓移植等方法來治療，雷公藤［1］、肉蓯蓉［2］、大蒜素［3］等傳統中藥提取物抗白血病的研究也取得一定成果，現在更多的學者把目光轉向了分子靶向治療。CD44作為白血病干細胞的標志之一，對急性髓系白血病干細胞的增殖和遷移等起重要的調節作用。在急性髓系白血病細胞上，主要表達 CD44s及 CD44v3-v10，其中以表達CD446v為主，急性髓系白血病患者CD44-6v的高表達提示其預后欠佳［4］，故CD44-6v可能有助于促進急性髓系白血病幼稚細胞的形成［5］。另外，對急性髓系白血病病人的研究還發現，骨髓中骨橋蛋白的含量遠高于正常人，而且其含量越高，預后越差［6］。

據報道，CD44抗體A3D8-H90或透明質酸能夠逆轉M1-M5各亞型的AML細胞及細胞系的分化阻滯，Song等［7］還發現另一種抗CD44抗體HI44a能夠有效的誘導白血病細胞分化及凋亡。本實驗中發現經CD44抗體HI44a處理的HL-60細胞形態發生改變，表現為細胞核變小，核質比例變大;粒系分化的指標CD15表達增強，說明HI44a能夠誘導HL-60細胞向粒系分化成熟。我們的結論與Song等的結論相符。

CD44V可以特異性的結合骨橋蛋白(OPN)［8－10］，介導 T 細胞、骨髓細胞的趨化和黏附作用［8，10－11］，抗 CD44 抗體可以削減 OPN 與 IL-3 對小鼠骨髓細胞的增殖作用［11］。OPN-CD44的相互作用在GM-CSF所介導的抗凋亡的信號轉導通路中發揮重要作用，當信號分子GM-CSF通過信號轉導促使編碼OPN的基因表達，產生OPN，與細胞表面的受體CD44分子作用后通過信號轉導網絡傳遞GM-CSF的抗凋亡信號［12］，研究者還發現在腫瘤細胞增殖過程中，OPN的表達逐漸增高，這與其抗凋亡的作用相符，因此，研究者致力于從OPN基因轉錄的調控因子中尋找特異靶點而阻斷其抗凋亡信號的轉導［5］。本實驗中發現，HI44a處理的HL-60細胞，增殖受抑，且漸向較成熟階段細胞分化，OPN表達下調，TGF-β1、GM-CSFRα 表達上調，推測 HI44a結合CD44分子后，阻斷了OPN-CD44所參與的信號通路中抗凋亡信號的轉導，使得抗凋亡信號轉導通路的信號分子OPN表達降低，而促凋亡的造血因子TGF-β1及促分化的信號分子GM-CSFRα表達增高，可能通過此相關途徑引發細胞的分化及凋亡，但確切機制需要進一步研究。

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